龚韬 ，佟彤 ，周德勇 ，严文利 ，夏波 ，杨怡雯 ，曹慧卓 ，刘红旭

（1.北京市中医药研究所，北京 100035；2.首都医科大学附属北京中医医院，北京 100010；3.杭州环特生物科技股份有限公司，杭州 310051）

心力衰竭是指由于心脏发生了结构和（或）功能异常，损害了心室充盈和（或）射血能力而导致的复杂临床综合征，是心血管疾病的终末期表现和最主要的死亡原因[1]，发病率仍在增长，已成为人类较为关注的心血管疾病之一。首都医科大学附属北京中医医院许心如教授在国内率先提出“泻肺利水法”治疗心力衰竭，以《金匮要略》葶苈大枣泻肺汤和防己黄芪汤为主方组成心力衰竭系列合剂，用于心力衰竭病的治疗并取得了良好的临床疗效[2]。在此基础上，北京中医医院心内科刘红旭主任根据多年临床经验，进一步对处方进行了精简化裁，形成了黄芪、葶苈子、桑白皮等5味药组成的泻肺利水方，用于临床治疗。本研究采用盐酸维拉帕米诱导的心力衰竭斑马鱼模型，评价泻肺利水方醇提物不同给药途径对斑马鱼心功能的影响。

1 材料与方法

1.1 药物 泻肺利水方由黄芪6 g、南葶苈子6 g、桑白皮3 g、防己3 g和香加皮6 g组成，其醇提物（批号20210330）为70%乙醇提取物（1 g 70%乙醇提取物相当于5.62 g生药），由北京市中医药研究所中药化学室提供。泻肺利水方醇提物注射给药，用二甲基亚砜（DMSO）配制成100 mg/mL母液，临用时按需稀释，-20℃储存；泻肺利水方醇提物水溶给药，用标准稀释水配制成2.00 mg/mL母液，现配现用。复方丹参滴丸，棕色滴丸，批号200749，天士力医药集团股份有限公司，阴凉储存；临用时用标准稀释水配制成20.0 mg/mL母液，现配现用。

1.2 实验动物 野生型AB品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后2 d（2 dpf）的斑马鱼用于样品心力衰竭改善功效最大检测剂量（MTD）和最大检测浓度（MTC）测定及其功效评价（表型和血流动力学）。斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中（水质：每1 L反渗透水中加入200 mg速溶海盐，电导率为 450～550 μS/cm；pH 为 6.5～8.5；硬度为50～100 mg/L CaCO3），由杭州环特生物科技股份有限公司养鱼中心繁殖提供，实验动物使用许可证号为：SYXK（浙）2012-0171，饲养管理符合国际AAALAC认证（认证编号：001458）的要求。

1.3 仪器与主要试剂 解剖显微镜（SZX7，OLYMPUS公司，日本）；CCD相机（VertA1，上海土森视觉科技有限公司，中国）；精密电子天平（CP214，OHAUS公司，美国）；心跳血流分析仪（ZebraBlood 3.4，ViewPoint Life Sciences公司，法国）。

DMSO，批号30072418，购自国药集团化学试剂有限公司；盐酸维拉帕米（批号K1629078）、甲基纤维素（批号B2006074），均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 最大检测剂量（MTD）和最大检测浓度（MTC）测定 随机选取2 dpf野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔（实验组）均处理30尾斑马鱼。分别静脉窦注射和水溶给予样品，剂量和浓度见表1。同时分别设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3 mL。样品处理4 h后，除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予盐酸维拉帕米建立斑马鱼心力衰竭模型。28℃处理0.5 h后，测定样品对模型斑马鱼的MTD和MTC。

1.4.2 心力衰竭改善功效评价（表型） 随机选取2dpf野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔（实验组）均处理30尾斑马鱼。分别静脉窦注射和水溶给予样品，剂量和浓度见表2、3。阳性对照复方丹参滴丸250μg/mL浓度，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3 mL。样品处理4 h后，除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予盐酸维拉帕米建立斑马鱼心力衰竭模型。28℃处理0.5 h后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于解剖显微镜下拍照，使用NIS-Elements D 3.20高级图像处理软件采集数据，分析斑马鱼心脏面积和静脉淤血面积，以该指标的统计学分析结果评价样品心力衰竭改善功效。

1.4.3 心力衰竭改善功效评价（血流动力学） 随机选取2 dpf野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔（实验组）均处理30尾斑马鱼。分别静脉窦注射和水溶给予样品，剂量和浓度见表4、5。阳性对照复方丹参滴丸250 μg/mL浓度，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3 mL。样品处理4 h后，除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予盐酸维拉帕米建立斑马鱼心力衰竭模型。28℃处理0.5 h后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于心跳血流分析仪下录制视频，使用ViewPoint Application Manager软件采集数据，分析斑马鱼血流速度和心输出量，以该指标的统计学分析结果评价样品心力衰竭改善功效。

1.4.4 统计学方法 采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。实验结果采用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验。P<0.05表明差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MTD和MTC测定 各组斑马鱼均未出现死亡现象，结果见表1。泻肺利水方醇提物对于心力衰竭斑马鱼注射给药的最大耐受给药剂量为100 ng/尾；水溶给药浓度为1 000 μg/mL和2 000 μg/mL时，给药组较模型对照组状态差，因此水溶给药的最大耐受给药浓度为500 μg/mL。故本研究中采用100、50、25 ng/尾作为注射给药的高、中、低剂量组的干预剂量；采用500、250、125 μg/mL作为水溶给药的高、中、低剂量组的干预浓度。

表1 心力衰竭改善功效剂量摸索实验结果Tab.1 Experimental results of exploring effective dose for improving heart failure

2.2 心力衰竭改善功效评价（表型） 泻肺利水方醇提物注射给药对斑马鱼均具有明显的心力衰竭改善功效，主要表现为对心脏面积和静脉淤血面积有明显的改善，低、中、高剂量组在心脏面积方面的改善率分别为33%、41%、34%，在静脉淤血面积方面的改善率分别为44%、57%、56%。水溶给药对心脏面积和静脉淤血面积改善不明显，低、中、高剂量组在心脏面积方面的改善率分别为-5%、7%、28%，在静脉淤血面积方面的改善率分别为-18%、-6%、-1%。详见表2、3。样品处理后斑马鱼心脏面积与静脉淤血面积典型图见图1。

图1 样品处理后斑马鱼心脏面积与静脉淤血面积典型图Fig.1 Typical diagram of heart area and venous congestion area of zebrafish after sample treatment

表2 样品心脏面积改善功效评价实验结果（±s）Tab.2 Experimental results of evaluation on the effect of sample heart area improvement（±s） 像素

表2 样品心脏面积改善功效评价实验结果（±s）Tab.2 Experimental results of evaluation on the effect of sample heart area improvement（±s） 像素

注：与模型对照组（水溶）比较，**P<0.01；与模型对照组（注射）比较，##P<0.01。

组别 动物数 浓度/剂量 心脏面积正常对照组 10 - 9 936±335**##模型对照组（水溶） 10 - 15 237±436模型对照组（注射） 10 - 15 966±404复方丹参滴丸 10 250 μg/mL 12 090±466**##泻肺利水方醇提物注射给药 10 25.0 ng/尾 14 001±378##10 50.0 ng/尾 13 470±343##10 100 ng/尾 13 936±305##泻肺利水方醇提物水溶给药 10 125 μg/mL 15 517±352 10 250 μg/mL 14 860±649 10 500 μg/mL 13 770±331

表3 样品静脉淤血面积改善功效评价实验结果（±s）Tab.3 Experimental results of evaluation on the effect of improving venous congestion area of samples（±s） 像素

表3 样品静脉淤血面积改善功效评价实验结果（±s）Tab.3 Experimental results of evaluation on the effect of improving venous congestion area of samples（±s） 像素

注：与模型对照组（水溶）比较，**P<0.01；与模型对照组（注射）比较，##P<0.01。

组别 动物数 浓度/剂量 静脉淤血面积正常对照组 10 - 693±86**##模型对照组（水溶） 10 - 9 466±382模型对照组（注射） 10 - 9 525±421复方丹参滴丸 10 250 μg/mL 5 699±353**##泻肺利水方醇提物注射给药 10 25.0 ng/尾 5 609±305##10 50.0 ng/尾 4 533±424##10 100 ng/尾 4 571±470##泻肺利水方醇提物水溶给药 10 125 μg/mL 11 028±532 10 250 μg/mL 10 017±568 10 500 μg/mL 9 570±466

2.3 心力衰竭改善功效评价（血流动力学） 泻肺利水方醇提物注射给药和水溶给药对斑马鱼均具有明显的心力衰竭改善功效，主要表现为对血流速度和心输出量有明显的改善。注射给药低、中、高剂量组对血流速度的改善率分别为33%、48%、58%，对心输出量的改善率分别为28%、38%、72%；水溶给药低、中、高剂量组对血流速度的改善率分别为23%、24%、28%，对心输出量的改善率分别为22%、22%、31%。详见表 4、5。

表4 样品血流速度改善功效评价实验结果（±s）Tab.4 Experimental results of sample blood flow velocity improvement efficacy evaluation（±s） μm/s

表4 样品血流速度改善功效评价实验结果（±s）Tab.4 Experimental results of sample blood flow velocity improvement efficacy evaluation（±s） μm/s

注：与模型对照组（水溶）比较，**P<0.01；与模型对照组（注射）比较，##P<0.01。

组别 动物数 浓度/剂量 血流速度正常对照组 10 - 722±27.4**##模型对照组（水溶） 10 - 295±28.8模型对照组（注射） 10 - 308±29.5复方丹参滴丸 10 250 μg/mL 516±29.3**##泻肺利水方醇提物注射给药 10 25.0 ng/尾 446±29.6 10 50.0 ng/尾 505±14.4##10 100 ng/尾 549±20.9##泻肺利水方醇提物水溶给药 10 125 μg/mL 394±16.0**10 250 μg/mL 399±13.3**10 500 μg/mL 416±22.2**

表5 样品心输出量改善功效评价实验结果（±s）Tab.5 Experimental results of sample cardiac output improvement efficacy evaluation（±s）nL/s

表5 样品心输出量改善功效评价实验结果（±s）Tab.5 Experimental results of sample cardiac output improvement efficacy evaluation（±s）nL/s

注：与模型对照组（水溶）比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型对照组（注射）比较，#P<0.05，##P<0.01。

组别 动物数 浓度/剂量 心输出量正常对照组 10 - 0.266±0.011**##模型对照组（水溶） 10 - 0.104±0.009模型对照组（注射） 10 - 0.111±0.015复方丹参滴丸 10 250 μg/mL 0.170±0.009**#泻肺利水方醇提物注射给药 10 25.0 ng/尾 0.155±0.010 10 50.0 ng/尾 0.170±0.006 10 100 ng/尾 0.222±0.011##泻肺利水方醇提物水溶给药 10 125 μg/mL 0.140±0.008*10 250 μg/mL 0.140±0.005*10 500 μg/mL 0.155±0.010**

3 讨论

心力衰竭归属于中医“心衰”“心悸”“怔忡”等范畴，其多因气血阴阳虚衰、脏腑功能失调导致，而心失所养、心血不运，则血脉瘀滞甚至血瘀水停。本病不仅对患者的生活质量和功能状况都造成了严重影响[3]，而且还带来了沉重的经济负担。目前对于心力衰竭的治疗，西药和非药物干预方法比较完善，但很多心力衰竭患者的病情恶化趋势及病死率并未得到有效控制。广大中医工作者通过大量临床实践发现，将中西医有效结合，可明显提高临床疗效，显示出中医药在心力衰竭临床治疗方面的独特性及优势[4-5]。许心如教授结合中医经典理论和临床实践，体会气虚血瘀水停是心力衰竭的重要病机，首创了泻肺利水法治疗心力衰竭，以《金匮要略》葶苈大枣泻肺汤和防己黄芪汤为主方组成心力衰竭系列合剂，根据患者的不同时期不同症候特点，加减使用，在临床中起到了很好的疗效[2]。为更好地将泻肺利水法应用于临床，方便于患者的用药，刘红旭主任将处方进一步精简为由黄芪、南葶苈子、桑白皮、防己和香加皮（泻肺利水方）组成，方中主药黄芪益气固表利水；南葶苈子、桑白皮泻肺平喘，利水化饮；防己、香加皮利水消肿。

目前，日常用于治疗心力衰竭的中西药物主要以口服给药为主，少有其他给药方式，如栓剂直肠给药。栓剂直肠给药对于心力衰竭患者而言，即避免了在汤剂和颗粒剂的服药过程中需服用一定量的水液，减少了水的摄入，又避免肝脏的首过效应，提高了药物的生物利用度，起到减量增效的作用。尤其对于卧病在床的老年患者，提高了药物使用的依从性。本研究通过比较泻肺利水方醇提物不同给药途径对斑马鱼心力衰竭模型心功能的影响，以探讨栓剂直肠给药的安全性及有效性。因斑马鱼无法做到直肠给药，仅有水溶给药和注射给药两种方式，水溶给药对应于常规的口服给药；注射给药虽不能等同于直肠给药，但比较接近。

斑马鱼是目前生命科学研究中重要的模式脊椎动物之一，既有与哺乳动物类似的生理生化特征，又有高效、快速、大规模的优势。斑马鱼的心血管系统在解剖结构和生理功能上与哺乳动物相似，包括心房和心室，血液通过动、静脉循环，有单独的淋巴循环。斑马鱼模型因具有对小分子的良好渗透性，可视性强等优势，因此在中药治疗心血管药理学研究领域中的应用日益增多[6]。如通过异丙肾上腺素（ISO）、马兜铃酸（AA）、阿霉素（DOX）等药物可诱发斑马鱼心力衰竭模型[7]。Zhu等[8]报道，用浓度为200 μmol/L的维拉帕米处理2 df的斑马鱼30 min，则出现心包水肿和静脉淤血，同时心输出量和血流速度显著降低，与心力衰竭患者的临床特征较为相似，为目前常用且较为成熟的斑马鱼心力衰竭模型。

由于斑马鱼是通过水溶（浸泡）给药和显微注射给药，与人类给药途径有所不同，因此可能影响药物在临床应用上的药效评估。斑马鱼对药物比较敏感，一旦不能耐受就会出现卵黄囊变黑和心率减慢等不良反应，同时受药物溶解性的影响，斑马鱼的给药剂量无法像其他实验动物一样根据人用剂量进行折算，所以在进行功效评价之前，需先进行最大给药剂量或最大给药浓度的检测，在此基础上来设定功效评价的低、中、高剂量，而非根据临床给药剂量进行设定。本研究结果显示，对于注射给药，受样品溶解度所限，泻肺利水方醇提物最大给药剂量仅可达到100 ng/尾，在此剂量下斑马鱼状态良好，故此剂量为最大耐受剂量。与模型对照组（注射）比较，泻肺利水方醇提物各剂量组均可显著降低心力衰竭斑马鱼心脏扩大和静脉淤血面积；中、高剂量组显著改善血流速度；高剂量组可明显增加心输出量。对于水溶给药，当给药浓度达到1 000 μg/mL以上时，给药组斑马鱼较模型对照组状态差，因此水溶给药的最大耐受浓度为500 μg/mL。与模型对照组（水溶）比较，泻肺利水方醇提物各剂量组对降低心力衰竭斑马鱼心脏扩大和静脉淤血面积无显著影响，但可增加血流速度和心输出量，尤其是高剂量组效果更为显著。两种不同给药途径的药效结果有所差异，可能与斑马鱼对药物的吸收有关，水溶给药可能会造成某些成分未真正全部溶解在水中，从而未进入到斑马鱼体内。同时受药物溶解度限制，注射给药最大给药剂量仅达到100 ng/尾，并未检测到真正的最大耐受剂量，从而并未给予到最佳的给药剂量。因此还有待进一步对泻肺利水方醇提物进行更深入的研究，从而能阐明其作用机制。