田 晶 隋海娟 陈 月 （锦州医科大学，锦州 121000）

流感病毒（influenza virus，IV）是呼吸道感染的重要病原体，由于变异快，尤其是动物源流感病毒在人群中的高致死率和广泛流行性已引起全世界高度关注［1］。固有免疫系统是抵抗流感病毒入侵的第一道防线，感染早期快速的固有细胞免疫应答能有效控制呼吸道上皮细胞感染及流感病毒复制［2］。巨噬细胞作为固有免疫系统重要的专职吞噬细胞，通过内化方式和溶酶体降解过程清除感染颗粒，以摄取凋亡细胞的形式去除病毒感染的细胞碎片［3］。此外，巨噬细胞M1 型（经典激活型）分泌TNF-α 和NOS 等炎症因子，帮助机体清除流感病毒。M2 型（替代激活型）具有抗炎功能，释放多种抗炎递质，参与组织修复［4-5］。巨噬细胞的双向调节作用对流感病毒免疫应答的平衡发挥重要作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 小鼠巨噬细胞株RAW264.7（SCSP-5036）购于中国科学院上海细胞库。

1.1.2 主要试剂 甲型流感病毒鼠肺适应株A/PR/8/34（H1N1，PR8）由国家疾病预防控制中心流感所馈赠；RNeasy Mini Kit 试剂盒购自德国QIAGEN；One Step SYBR®Prime ScriptTMRT-PCR Kit购自日本TaKaRa公司；TLR4、NF-κB和Influenza NP 抗体购自美国 Abcam 公司；Fixation/Permeabilization solution和BD Perm/WashTMBuffer 购自美国BD 公司；细胞凋亡-Hoechst 染色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；DMEM 培养基、胎牛血清、牛血清白蛋白、TPCK-胰酶和HEPES缓冲液购自美国Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 流感病毒PR8 鸡胚培养 用1 ml 注射器吸取200 µl 流感病毒PR8 接种于8~11 日龄的鸡胚尿囊腔，用无菌医用胶布将裂口封好。36 ℃孵育2~3 d，将鸡胚置于−20 ℃1 h即可无菌收集尿囊液。1 200 g离心15 min 去除沉淀。取少量用于病毒滴度检测，其余1.5 ml/管分装于2 ml冻存管，−80 ℃保存。……