盛 涛， 孟庆斌， 李学齐， 孙彩玉， 贾明珠

(黑龙江科技大学 环境与化工学院， 哈尔滨 150022)

0 引 言

我国是农业生产大国，每年农作物秸秆产量约9 亿t，但绝大部分没有被合理利用，这不仅导致资源的浪费，同时也是温室气体的主要来源[1-3]。秸秆的主要成分是纤维素、半纤维素及木质素。纤维素及半纤维素是重要的可再生碳水化合物，其糖化产物可作为生产清洁能源和高值化学品的原料。

秸秆类生物质的资源化一般需要预处理、糖化和发酵3个过程。其中，糖化是木质纤维素类生物质资源化利用的核心步骤，也是限速步骤[4]。常见的秸秆糖化方式包括纤维素酶糖化法与酸糖化法。与酸糖化法相比，纤维素酶糖化法设备要求低，水解效率高，条件温和且不产生影响下游发酵的抑制物。纤维素酶包括内切葡聚糖苷酶(Endocellulose)、外切葡聚糖苷酶(Exocellulose)以及β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)，纤维素类生物质的糖化由3种纤维素酶协同作用完成。商品纤维素酶大多由里氏木霉(Trichoderma reesei)和黑曲霉(Asperillium niger)发酵产生。里氏木霉的内切葡聚糖苷酶及外切葡聚糖苷酶的活性较高，但β-葡萄糖苷酶的活性较低；黑曲霉可高效降解木聚糖等半纤维素，但缺乏特定的纤维素酶组分[5]。单一真菌分泌的纤维素酶水解纤维素能力比较有限，为解决这个问题，通常需要将不同真菌产生的纤维素酶进行复配，以求达到最佳糖化效果，这直接增加了纤维素酶的成本。与真菌分泌的游离酶不同，厌氧细菌通过细胞表面分泌一种多酶复合物降解纤维素，其称为纤维小体。热纤梭菌(Ruminiclostridiumthermocellum)是一种能够利用纤维素的嗜热厌氧革兰氏阳性细菌，其产生的纤维小体是迄今为止研究最广、降解纤维素效果最有效的纤维酶复合体之一[6]。但是，热纤梭菌纤维小体降解纤维素的产物主要是纤维二糖，纤维二糖的积累会导致纤维小体的反馈抑制，严重影响了纤维素类生物质的糖化效率[7]。因此，找到具有纤维二糖降解能力的热纤梭菌，研究其代谢纤维二糖的规律对提高生物质能源利用至关重要。

本课题组在前期研究中筛选到一株可高效糖化木质纤维素的微生物热纤梭菌M3(R.thermocellumM3)[8]，菌株M3不仅可糖化纤维素类底物，且糖化产物中单糖的含量高达97%，纤维二糖仅占2%左右，这说明菌株M3可有效消除纤维二糖的反馈抑制。同时，批式发酵是目前应用最为广泛的细菌培养方式，培养基一次性投加，产品一次性收获，工艺简单，时间短、效率高。在批式发酵过程中，可以获得细菌代谢过程中的瞬时变化规律，更好地反应其代谢特点。因此，笔者旨在通过批式培养R.thermocellumM3探究其在不同纤维二糖浓度下纤维素酶活变化和生长特性，并筛选出与纤维二糖降解相关的差异基因，为构建高效降解木质纤维素菌株提供有效可靠的靶点。

1 材料与方法

1.1 菌株来源与培养基成分

热纤梭菌R.thermocellumM3保藏在黑龙江科技大学环境与化工学院微生物实验室。

配置纤维二糖降解培养基1 000 mL，经过高温除氧和调节pH为7.5后装入充好氮气的厌氧瓶中密封，在115 ℃下灭菌15 min。培养基成分：K2HPO4，1.5 g/L；KH2PO4，3 g/L；MgSO4·7H2O，0.2 g/L;CaCl2·2H2O，0.05 g/L；(NH4)2SO4，1.0 g/L；NaCl，1.0 g/L；KCl，0.2 g/L；纤维二糖质量浓度分别为10、20及30 g/L。

1.2 实验设计

所有样本均采用100 mL厌氧瓶进行培养，设置3种纤维二糖质量浓度分别为10、20、30 g/L，分别按10%的菌体接种量于60 ℃和30 ℃、pH为7.5的条件下培养14 d。每24 h取一次样，考察R.thermocellumM3降解纤维二糖的3种纤维素酶活变化及菌体生长情况。

1.3 分析方法

内切葡聚糖苷酶酶活：将1 mL粗酶液与1 mL用柠檬酸缓冲液配置的浓度为1%羧甲基纤维素钠溶液混合后在50 ℃下振荡30 min，用DNS法测量混合液中葡萄糖产量。一个酶活单位 [IU] 定义为每分钟释放1 μmol葡萄糖当量的酶的量[9]。

外切葡聚糖苷酶酶活：将1 mL粗酶液与1 mL用柠檬酸缓冲液配置的浓度为1%微晶纤维素溶液混合后在50 ℃下振荡30 min，用DNS法测量混合液中葡萄糖产量。一个酶活单位 [IU] 定义为每分钟释放1 μmol葡萄糖当量的酶的量[9]。

β-葡萄糖苷酶酶活：测定方法参照Ghose等(1987)[10]所描述的方法，以4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)为底物测定β-葡萄糖苷酶活性。在60 ℃下，将样品与含有2 mmol pNPG、50 mmol柠檬酸盐缓冲液和15 mmol CaCl2(pH=6)的200 μL溶液孵育20 min，添加50 μL 1 mol的Na2CO3后终止反应，并测量405 nm处的吸光度。β-葡萄糖苷酶活性表示为单位体积酶液每分钟所产生pNP的量(μmol)。

细胞生长量：以菌体吸光度值变化代表细胞增长变化趋势，采用分光光度计在600 nm处测定样品的吸光度值代表菌浊η，样品与空白培养基之间的差值即细胞浓度。

2 结果与讨论

2.1 底物质量浓度

图1是R.thermocellumM3在温度为60 ℃的条件下，以不同质量浓度纤维二糖为底物产纤维素酶的酶活变化情况。从图1可以看出，底物质量浓度为10 g/L时，R.thermocellumM3的β-葡萄糖苷酶活性最高为0.314 IU/mL，随着底物质量浓度从10 g/L增长到30 g/L时，β-葡萄糖苷酶活性出现了不同程度降低。较高的底物负荷可以节约工艺的成本，但过高的底物质量浓度会对细菌的生长形成反馈抑制,进而影响纤维素酶的分泌。有研究表明，当纤维二糖浓度超过2%时，热纤梭菌的生长会受到抑制[12]。值得注意的是,R.thermocellumM3生长在不同质量浓度纤维二糖下分泌的β-葡萄糖苷酶活性展示出了相同的趋势，先降低再逐渐升高并存在一定的延滞期，相比于其他两种质量浓度的样本，纤维二糖质量浓度为10 g/L的样本在培养初期可以观察到更明显的下降趋势。推测菌株在纤维二糖生长初期所测得的β-葡萄糖苷酶活来自于种子液，此时β-葡萄糖苷酶被用来分解纤维二糖产生葡萄糖为细菌的生长提供原料并帮助细菌逐渐适应新的生存环境，当底物质量浓度过高时会抑制菌株对底物的利用。表1为不同温度下、不同质量浓度纤维二糖对R.thermocellumM3菌体生长的影响。培养温度为30 ℃、底物质量浓度为10、20、30 g/L时，菌体的菌浊分别记为η30-10、η30-20、η30-30；培养温度为60 ℃、底物质量浓度为10、20、30 g/L时，菌体的菌浊分别记为η60-10、η60-20、η60-30。

图1 60 ℃下不同底物质量浓度下R. thermocellum M3降解纤维二糖酶活特性Fig. 1 Enzyme activity characteristics of R. thermocellum M3 degrading cellobioseunder different substrate concentrations at 60 ℃

从表1中可以看出R.thermocellumM3在纤维二糖上生长出现了一定的延滞期。内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶是纤维素酶中至关重要的两种酶，当R.thermocellumM3生长在以纤维二糖为碳源的底物上时，内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶始终呈现出下降的趋势，这是因为内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的作用是降解纤维素无定型区域和结晶区域，由于酶的生产需要底物的诱导，所以该菌株在缺乏纤维素的底物中分泌的酶活性较低。Johnson 等[13]研究发现，纤维二糖作为底物时可显著抑制热纤梭菌纤维小体中外切葡萄糖苷酶的合成。Raman[14]对热纤梭菌生长降解纤维二糖过程进行定量蛋白质组学分析，结果表明，热纤梭菌中的纤维素体亚基组成具有底物特异性调节能力，以更好地适应生物体在不同条件下的生长需要，与生长在纤维素上相比，生长在纤维二糖上时，锚定蛋白Olpb，外切葡聚糖酶基因CelS、CelK,内切葡聚糖酶基因CelJ(GH9)表达降低。

表1 不同温度、不同质量浓度纤维二糖对R. thermocellum M3菌体生长的影响

2.2 温度条件

从图2中可以看出，培养温度为30 ℃时，R.thermocellumM3在3种不同底物质量浓度下产生的β-葡萄糖苷酶活性始终高于内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶，这与R.thermocellumM3在高温下降解纤维二糖的酶活特性相同。在以质量浓度为10 g/L的纤维二糖培养基中所检测出的β-葡萄糖苷酶酶活性最高，达到0.148 IU/mL，其次是质量浓度为20 g/L和30 g/L的纤维二糖培养基，活性分别为0.124 IU/mL和0.113 IU/mL。可以看出,随着底物质量浓度的升高，并没有对β-葡萄糖苷酶的活性造成太显著的影响。

图2 30 ℃下R. thermocellum M3降解不同质量浓度纤维二糖酶活特性Fig. 2 Enzyme activity characteristics of R. thermocellum M3 degrading different concentrations of cellobiase at 30 ℃

热纤梭菌是一种革兰氏阳性嗜热厌氧菌，在纤维素等为底物时的最佳生长温度为55～60 ℃[8]。从表1中可以看出，以纤维二糖为底物时R.thermocellumM3在30 ℃培养条件下的菌浊高于60 ℃。纤维二糖作为底物时，β-葡萄糖苷酶将纤维二糖水解为葡萄糖，葡萄糖进入细菌的糖酵解环节生成丙酮酸，丙酮酸进一步降解生成乙酸和乳酸等代谢副产物,同时为细胞的新陈代谢提供ATP。有研究发现[15]，高温条件下有利于热纤梭菌生长，但纤维小体中承载纤维素酶的支架蛋白在高温条件下不稳定，因此细菌分泌的酶活稳定性会受到抑制，进而不能为细菌生长提供足够的营养物质和能量。同时，菌体产生的代谢副产物会影响菌体细胞本身的生长。Herrer等[16]对热纤梭菌在不同底物上的生长温度进行了考察，结果表明，热纤梭菌的最佳生长温度并不是最佳酶活温度，同时纤维素酶的分泌与细胞的生长息息相关。

2.3 KEGG代谢通路

Sheng等[8]研究发现，R.thermocellumM3不仅可糖化纤维素类底物，且糖化产物中单糖的质量分数高达97%，纤维二糖仅占2%左右。本研究的结果表明，R.thermocellumM3可以在纤维二糖质量分数超过2%的底物上生长，虽然β-葡萄糖苷酶的活性有所降低，但并没有被完全抑制，R.thermocellumM3纤维小体可在一定程度上缓解纤维二糖的反馈抑制作用。为了研究差异基因涉及的通路，对差异基因进行了KEGG代谢通路分析。结果显示，与纤维二糖降解相关的基因包括BglA(EC3.2.1.86)、BglX(EC3.2.1.21)与BglB(EC3.2.1.21)，由图3可以看出，BglA (EC3.2.1.86)基因涉及的通路是Gly-

图3 R. thermocellum M3 降解纤维二糖KEGG相关通路(部分)Fig. 3 KEGG pathways of R. thermocellum M3 degrading cellobiose (part)

colysis(糖酵解)：map00010及Starch and sucrose metabolism(淀粉及蔗糖代谢)：map00500代谢通路。在淀粉及蔗糖代谢通路下，BglA主要的功能是将一分子磷酸化纤维二糖转化为一分子葡萄糖和一分子磷酸化葡萄糖，随后进入糖降解途径转化为丙酮酸盐并产生少量的ATP(能量)和NADH(还原力)[17]，与此同时，熊果苷与水杨苷类物质也可被BglA转化为磷酸化葡萄糖，最终进入糖酵解代谢路径。BglX(EC3.2.1.21)和BglB(EC3.2.1.21)基因主要涉及淀粉及蔗糖代谢通路，BglB是热纤梭菌中常见的β-葡萄糖苷酶基因，其主要的功能是将一分子纤维二糖分解为两分子葡萄糖，有研究表明，BglB在有低浓度葡萄糖存在的时候会受到抑制，并且温度较高会对该基因表达的稳定性产生影响[18]。

3 结 论

(1)R.thermocellumM3在批式培养下以纤维二糖为底物时，细菌的生长具有延滞性，检测出最大β-葡萄糖苷酶酶活为0.314 IU/mL，随着底物浓度的升高，β-葡萄糖苷酶酶活逐渐降低，葡聚糖酶和外切葡聚糖酶酶活远低于β-葡萄糖苷酶酶活。

(2)以纤维二糖为底物时，R.thermocellumM3在30 ℃培养条件下的β-葡萄糖苷酶酶活低于60 ℃培养条件下，但菌体的生长能力与酶活呈负相关。

(3)与纤维素相比，R.thermocellumM3降解纤维二糖有3个基因表达差异明显，分别为BglA、BglB和BglX，以上基因涉及的代谢通路分别是糖酵解通路和淀粉与蔗糖代谢通路。