江思思，刘俊伟，陆 旸

(1. 天津科技大学食品科学与工程学院，天津 300457；2. 天津国际生物医药联合研究院，天津 300457)

与其他常见的呼吸道传播病原体相比，新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的潜伏期更长、传染性更强，早诊断、早发现、早隔离仍然是疫情防控的关键[1-2]．现在以具有高特异性、高灵敏度等特点的核酸检测作为新型冠状病毒的主要检测手段[3]，但由于RNA不太稳定，容易降解，所以对样品的采集、运输及提取要求很高；另外，还存在检测时间长、实验条件依赖度高等问题．就检测时间而言，仅PCR温度改变的过程就需要2h，加上样本处理的时间，整个检测过程需几小时甚至更长时间．就实验条件而言，核酸检测需要专用的PCR仪和专业实验人员，并且要在安全等级至少为2级的生物安全实验室进行检测[4]．

酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是免疫学与酶学相结合的免疫分析方法．抗原与抗体特异性结合，并在酶的高效催化下，使该方法具有较高的特异性和灵敏度．同时，ELISA实验操作简单，实验要求不高，可在普通实验室内检测，2h内出检测结果，在食品安全、临床医学、微生物及病毒检测等多个领域被广泛运用[4-6]. 免疫层析技术(lateral flow assay，LFA)，又称为侧向层流技术，是一种以毛细作用为驱动力的快速检测方 法[7-8]. 其中以纳米材料胶体金作为免疫标记的免疫层析法操作简单，具有耗时短、价格低廉、结果稳定等特点，可在10～15min内出结果，易于进行商品化和标准化，常用于快速诊断和现场检测，是LFA中运用最广泛的方法[9-10]．相较于核酸检测，以免疫学为基础的ELISA和LFA检测方法具有检测时间短、操作步骤简单和实验要求低等特点，逐渐成为一种重要的检测手段[4].

SARS-CoV-2是正链RNA冠状病毒，有4种结构蛋白[11-12]，其中核衣壳蛋白(N蛋白)因高度保守且有良好的免疫原性，常用于检测新型冠状病毒的单克隆抗体制备[13-14]．因此，本文将N蛋白作为抗原制备出特异性高的单克隆抗体并建立了间接竞争ELISA法和胶体金免疫层析试纸条法，用于快速检测SARS-CoV-2的N蛋白．

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物与细胞

含有新型冠状病毒重组N蛋白基因序列的大肠杆菌(E. coli)BL21(DE3)菌株，天津国际生物医药研究院；雌性Balb/c免疫小鼠，天津市奥易德实验用品有限公司；SP2/0骨髓瘤细胞，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司．

1.1.2 试剂与仪器

二甲基亚砜，德国Merck公司；脱脂乳粉，美国BD公司；牛血清白蛋白(BSA)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、柠檬酸、β-糊精、过氧化氢脲、3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)、三羟甲基氨基甲烷(THAM)、聚乙二醇(PEG，50%)、PEG 200、PEG 20000、氯金酸、柠檬酸三钠、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，美国Sigma公司；HRP-羊抗鼠IgG酶标二抗(羊抗鼠二抗)、酶标稀释液，美国Promega公司；DMEM低糖培养基、胎牛血清、HAT选择性培养基、HT选择性培养基，美国Gibco公司；卡那霉素、IPTG诱导剂、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、咪唑、石蜡油、红细胞裂解液，北京索莱宝生物科技有限公司；酵母提取物、胰蛋白胨，北京酷来博科技有限公司；Triton X-100，生工生物工程(上海)股份有限公司；其他化学试剂均为分析纯试剂，国药集团化学试剂有限公司．

超声波破碎细胞机，上海秉越电子仪器有限公司；亲和层析镍柱，北京索莱宝生物科技有限公司；酶标仪、紫外分光光度计、CO2细胞培养箱、－80℃冰箱、细胞培养板、25cm2细胞培养瓶，美国Thermo公司；冷冻离心机，德国Eppendorf公司；高压灭菌锅，日本Hirayama公司；倒置显微镜，日本Nikon公司；双维往复划膜仪、微电脑自动斩切机，上海金标生物科技有限公司；型号为CN140和CN95的硝酸纤维素(NC)膜，德国Sartorious公司；型号为HF180的NC膜，美国Millipore公司；型号为NC90的NC膜，美国Pall公司．

1.2 实验方法

1.2.1 重组抗原N蛋白的表达与纯化

将大肠杆菌BL21(DE3)进行平板划线培养， 37℃培养过夜获得单克隆菌落．将单克隆菌落移至800mL的LB培养基中，37℃振荡扩大培养．在菌液中加入800μL 1mmol/L IPTG诱导剂，16℃继续培养18h进行蛋白质的表达；表达完成后将菌液离心并收集菌落，用缓冲液(20mmol/L HEPES、150mmol/L NaCl、5%甘油，pH 7.5)将沉淀悬浮，-20℃保存．

用超声破碎机将已表达的菌体破碎至澄清透明并离心，将离心后的上清液加到已平衡好的镍柱中，4℃振荡结合4～5h．用洗脱液(20mmol/L HEPES、150mmol/L NaCl、5%甘油、100mmol/L咪唑，pH 7.5)洗脱杂质蛋白，用洗脱液(20mmol/L HEPES、150mmol/L NaCl、5%甘油、500mmol/L咪唑，pH 7.5)洗脱目的蛋白．将目的蛋白转移到超滤管中，加入一定量0.01mol/L PBS缓冲液，离心超滤60min进行换液浓缩；收集上层液体，即为N蛋白．用BCA试剂盒测定N蛋白的质量浓度并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验，用Image J对凝胶图进行灰色度分析，计算其纯度．

1.2.2 N蛋白单克隆抗体的制备

选用精神状态良好、生长正常的10周龄Balb/c雌性小鼠5只，将上述纯化的重组N蛋白作为免疫抗原，用0.9%生理盐水进行稀释后，与佐剂等体积混合，充分乳化后对小鼠进行腹腔注射免疫．每次免疫间隔两周，共免疫4次，用间接ELISA法测定小鼠免疫血清的效价．选择效价最高的小鼠进行冲刺免疫，3d后取其脾细胞，在PEG200的作用下与骨髓瘤细胞进行细胞融合．用HAT选择性培养基筛选杂交瘤细胞，选出450nm处吸光度(A450)最高的杂交瘤细胞株制备单克隆抗体．本文采用正辛酸-饱和硫酸铵沉淀法对小鼠腹水进行纯化．

1.2.3 间接竞争ELISA法

用0.05mol/L碳酸钾溶液稀释N蛋白后加到酶标板中，每孔100µL，4℃过夜；弃孔中液体，用0.01mol/L PBST洗板3次后，每孔加入含0.5%脱脂乳粉的封闭液200µL，37℃孵育1h进行封闭，洗板3次；每孔加入样品溶液50μL、N蛋白单克隆抗体50μL，37℃孵育1h，洗板4次；加入已稀释10000倍的羊抗鼠二抗，每孔100μL，37℃孵育30min，洗板5次；加入底物液，每孔100μL，显色，37℃反应15～30min；加入终止液，每孔50μL，终止显色，利用酶标仪测定A450．按照式(1)计算小鼠抗体的抑制率，并绘制抑制曲线．

式中：A对照为加50μL抗体和50μL PBS缓冲液的A450，A测定为加50μL抗体和50μL N蛋白的A450，A空白为加100μL PBS缓冲液的A450．

对N蛋白包被量、抗体稀释倍数、稀释液pH及封闭条件进行优化，用最优条件参数进行实验，建立标准曲线．

1.2.4 胶体金免疫层析试纸条法

通过柠檬酸三钠还原法制备胶体金，将胶体金与N蛋白单克隆抗体相连制备金标抗体，以此作为试纸条实验的探针．将羊抗鼠二抗和N蛋白分别作为质控线(C线)和检测线(T线)包被在NC膜上，37℃烘干后组装并切割试纸条．将适量的金标探针与100μL 0.01mol/L PBS缓冲液混匀后滴到样品垫上，10min后观察结果．胶体金免疫层析试纸条法采用竞争法检测新型冠状病毒N蛋白，样品中的新型冠状病毒N蛋白与T线上的N蛋白竞争金标抗体，导致T线上的颜色与样品中N蛋白浓度成反比．

对实验条件中的羊抗鼠二抗和N蛋白的稀释倍数、NC膜种类、碳酸钾溶液和抗体的添加量、上样缓冲液的种类及pH进行优化，用最优条件参数进行试纸条实验，确定可视检测限(vLOD)和临界值．

2 结果与讨论

2.1 重组抗原N蛋白的鉴定

超滤后N蛋白的(SDS-PAGE)电泳分析图如图1所示．

图1 超滤后N蛋白的SDS-PAGE电泳分析图 Fig. 1 SDS-PAGE analysis of N protein after ultrafiltration

超滤后蛋白质的相对分子质量约为4.7×104，已知新型冠状病毒N蛋白含有419个氨基酸，相对分子质量约为4.74×104[15]，由此可以确定成功制备出N蛋白．用Image J对凝胶图进行灰色度分析，计算出N蛋白的纯度为90%左右，用BCA试剂盒测定其质量浓度为0.5mg/mL．

2.2 N蛋白单克隆抗体的制备

2.2.1 小鼠免疫血清效价的测定

三免和四免后1周，对5只小鼠采血并测定其免疫血清的效价，结果见表1．

表1 三免和四免后免疫血清效价的测定结果 Tab. 1 Results of immune serum titer after the third and fourth immunization

由表1可知：每只小鼠在免疫后，其免疫血清效价都提高了，其中1号小鼠在四免后免疫血清的效价最高，为1﹕5.12×105，故选用1号小鼠进行细胞 融合实验．

2.2.2 细胞融合及筛选

将免疫血清效价最高的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合并经过3次筛选，选出3株效价最高的细胞株1F5、2B3和2G3进行两次亚克隆，结果见表2．由表2可知：2G3两次亚克隆的阳性比率都低于50%，不能稳定地产生抗体，而1F5和2B3这两株细胞株，两次亚克隆的阳性比率都高于90%，故选取这两株细胞所克隆的并且效价最高的单克隆细胞株(编号分别为1F57A6G、2B39F2B)进行后续扩大培养并制备单克隆抗体．

表2 筛选细胞的两次亚克隆结果 Tab. 2 Results of two subclones of screened cells

2.2.3 单克隆抗体效价的测定

以每孔1μg的N蛋白包被量，用质量浓度均为8mg/mL的2B39F2B和1F57A6G两种单克隆抗体通过间接ELISA法测定其效价，结果见表3．当A450为0.8～1.2时，2B39F2B对应的效价为1﹕1.024×106，比1F57A6G的效价(1﹕5.12×105)更高，说明2B39F2B中特异性抗体的浓度更高，故选用2B39F2B用于后续的实验．

表3 纯化后单克隆抗体效价的测定结果 Tab. 3 Determination results of titer of purified monoclonal antibody

2.3 间接竞争ELISA法的建立

2.3.1 N蛋白包被量及抗体稀释倍数的确定

分别选取6个不同的孔包被量0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5µg，再分别选取9个不同的N蛋白单克隆抗体稀释倍数7.5×104、1.5×105、3×105、5×105、1×106、2×106、4×106、7×106、1×107，采用棋盘法组合不同包被量和抗体稀释倍数．用间接ELISA法测定其A450，选择A450在1.0附近的组合并通过标准曲线计算IC50．包被量及抗体稀释倍数优化结果见表4．当包被量由每孔0.1μg升至每孔0.5μg时，抗体稀释倍数和IC50逐渐增大，这可能是由于包被过量形成多层抗原吸附，在操作过程中抗原可能会发生脱落而降低了灵敏度．当包被量由每孔0.1μg降至每孔0.01μg时，抗体稀释倍数逐渐降低，IC50却逐渐增大，这可能是由于包被量太低导致显色不稳定．当包被量为每孔0.1μg时，显色较为稳定，且IC50最低，因此选择每孔0.1μg的包被量和1﹕2×106的抗体稀释倍数为最佳优化条件．

表4 包被量及抗体稀释倍数优化结果 Tab. 4 Optimization results of coating amount and antibody dilution ratio

2.3.2 封闭液的优化

封闭液的作用是封闭酶标板上未被蛋白质包被的孔，减少实验误差．选取质量分数分别为0.5%和1%的脱脂乳粉和BSA制备封闭液进行实验，结果见表5．

表5 封闭液优化结果 Tab. 5 Optimization results of blocking buffer

由表5可知：脱脂乳粉对应的IC50都低于BSA对应的IC50，表明脱脂乳粉的封闭效果优于BSA．通常由于BSA中只有单一的蛋白质，抗体与之结合发生交叉反应的概率很低；而脱脂乳粉有更多种类的蛋白质，且存在脱脂不完全的可能，未完全去除的脂质会影响蛋白质与酶标板底孔的结合，进而影响封闭效果．然而，实验中脱脂乳粉的封闭效果优于BSA，其可能原因：一是因为所购买的脱脂乳粉脱脂完全；二是N蛋白单克隆抗体特异性很好，不会与脱脂乳粉发生交叉反应；三是脱脂乳粉中含有更多种类的非特异性蛋白，具有更好的封闭作用．0.5%脱脂乳粉对应的IC50为24.60μg/L，低于1.0%脱脂乳粉所对应的IC50(31.08μg/L)．这可能是因为封闭液浓度过高，在一定程度上会阻挡抗原的结合表位，影响抗体与抗原的结合，导致灵敏度降低，故选择0.5%脱脂乳粉为最佳封闭条件．

2.3.3 稀释液pH的优化

选取pH为5.7、7.4和8.5的PBS进行间接竞争 ELISA实验，稀释液pH优化结果见表6．结果表明：当稀释液pH为酸性或碱性时，其IC50都比pH为中性时高，检测的灵敏度下降．其原因可能是酸/碱条件抑制了蛋白质的活性或使其发生变性，影响抗体捕获抗原的灵敏度以及酶促反应的效果[16]，故选稀释液pH7.4为最佳实验条件．

表6 稀释液pH优化结果 Tab. 6 Optimization results of pH of solution

2.3.4 N蛋白间接竞争ELISA标准曲线的绘制

通过上述实验的优化后，用N蛋白单克隆抗体建立的间接竞争ELISA法最佳条件为：包被量为每孔0.1μg，抗体稀释2×106倍，用0.5%脱脂乳粉制备封闭液，酶标稀释液二抗稀释2×105倍，用pH 7.4的PBS缓冲液稀释抗体和标准品．在最优条件下进行间接竞争ELISA实验，绘制其标准曲线如图2所示，该方法的灵敏度IC50为(22.16±1.77)μg/L，检测限IC15为(0.31±0.75)μg/L．

图2 N蛋白间接竞争ELISA标准曲线 Fig. 2 Standard curve of N protein by indirect competitive ELISA

2.4 胶体金免疫层析试纸条法的建立

2.4.1 胶体金的制备

通过柠檬酸三钠还原法制备胶体金，溶液呈酒红色，均匀透亮，无沉淀和杂质．用酶标仪设置紫外分光波长400～600nm扫描胶体金溶液的吸收峰，其最高吸收峰对应波长为519nm(图3)，参考文献[17]制备出的胶体金颗粒直径约为17nm．

图3 胶体金紫外分光扫描波长图谱 Fig. 3 UV scanning wavelength spectrum of colloidal gold

2.4.2 羊抗鼠二抗和N蛋白稀释倍数的选择

将羊抗鼠二抗和N蛋白用PBS缓冲液分别稀释一定倍数后划在NC膜上，进行免疫层析实验，结果见表7．

表7 羊抗鼠二抗和N蛋白稀释倍数的选择 Tab. 7 Optimization of goat anti-mouse secondary antibody and N protein dilution ratio

当羊抗鼠二抗和N蛋白的稀释倍数分别大于20和10时，出线颜色太浅；当羊抗鼠二抗和N蛋白的稀释倍数分别小于20和10时，出线颜色过深；当羊抗鼠二抗和N蛋白分别稀释20倍和10倍时，出线颜色基本一致且适中．因此，选择羊抗鼠二抗稀释20倍、N蛋白稀释10倍作为最佳稀释条件．

2.4.3 NC膜的优化

选Sartorious公司型号CN140和型号CN95、Millipore 公司型号HF180和Pall公司型号NC90 的NC膜分别组装成试纸条进行实验，结果如图4 所示．

图4 NC膜的优化 Fig. 4 Optimization of different NC membrane

由图4可知：NC90和HF180对应的C线颜色深于T线，且HF180有背景干扰，使显色不清晰；CN140和CN95对应的C线与T线颜色基本一致，但CN95的背景更干净，显色更清晰，故选择CN95型号的NC膜作为最佳实验条件．

2.4.4 碳酸钾溶液添加量的优化

酸碱度对胶体金与抗体的标记至关重要，添加不同量的K2CO3溶液可以调节胶体金与抗体结合过程的pH，结果如图5所示．当K2CO3溶液添加量大于5μL时，C线、T线颜色逐渐变浅，这可能是因为此时溶液的pH高于抗体的等电点，使抗体与胶体金之间的电荷发生排斥而限制两者的吸附．当K2CO3溶液添加量小于5μL时，C线略浅于T线，这可能是因为此时溶液的pH低于抗体的等电点，使胶体金发生凝集作用[18]. 当K2CO3溶液添加量为5μL时，C线、T线颜色基本一致且清晰，这是因为此时溶液的pH呈中性，使抗体与胶体金颗粒之间的静电作用最小、疏水作用较大，抗体能充分与胶体金颗粒稳定结合. 故选5μL作为K2CO3溶液最佳添加量．

图5 碳酸钾溶液添加量的优化 Fig. 5 Optimization of different volume of K2CO3 solution

2.4.5 抗体添加量的优化

在K2CO3溶液添加5μL条件下，添加不同量的N蛋白单克隆抗体与胶体金结合，结果如图6所示．当抗体添加量为1μL时，C线、T线颜色很浅，这是因为抗体添加量过少，胶体金与抗体未充分结合．当抗体添加量大于3μL时，C线与T线颜色基本一致，且不再发生变化，这说明当抗体添加量为3μL时，胶体金与蛋白质结合已经处于饱和状态．考虑到添加过多的抗体会降低方法的灵敏度并提高成本，抗体最佳添加量选择3μL．

图6 抗体添加量优化 Fig. 6 Optimization of different volume of antibody

2.4.6 上样缓冲液种类的优化

不同的缓冲液影响金标抗体与C线、T线的反应，进而影响C线、T线出线颜色．选取100μL pH为7.4的PB、PBS、PBST、BB作为上样缓冲溶液，与金标抗体混匀后按照上述已优化的实验条件进行试纸条实验，结果如图7所示．当缓冲液为PB和BB时，C线、T线颜色较浅；当缓冲液为PBST时， C线略浅于T线；当缓冲液为PBS时，C线、T线颜色基本一致且颜色适中，故选择PBS为最佳缓冲液种类．

图7 上样缓冲液种类的优化 Fig. 7 Optimization of different solution buffer

2.4.7 上样缓冲液pH的优化

将最优上样缓冲液的pH调节为5.7、7.4和8.5，与金标抗体混匀后按照上述已优化的实验条件进行试纸条实验，结果如图8所示．当pH为5.7时，C线略浅于T线；当pH为8.5时，C线略深于T线；当pH为7.4时，C线、T线颜色基本相同．这可能是因为过酸或过碱的环境都会影响蛋白质的活性，使蛋白质之间不能有效结合，当pH为6～8时更有利于蛋白质的结合[16]，故选择pH为7.4的上样缓冲液作为最佳条件．

图8 上样缓冲液pH的优化 Fig. 8 Optimization of different pH of PBS buffer

2.4.8 胶体金免疫层析试纸条检测限的确定

取100μL上样缓冲液将N蛋白溶液稀释为31、62、125、250、500、1000μg/L，与探针混合后按照上述已优化的实验条件进行实验，结果如图9所示．

图9 胶体金免疫层析试纸条检测限的确定 Fig. 9 Detection limit of colloidal gold-labeled immunochromatographic test strips

当待测N蛋白质量浓度为500μg/L时，T线完全消失，故本方法的临界值为500μg/L；当待测N蛋白质量浓度为62μg/L时，T线比C线略浅一点．故本方法的可视检测限为62μg/L．

3 结 论

本研究以新型冠状病毒抗原为检测目标物建立了两种免疫检测方法．间接竞争ELISA法的最优条件为：N蛋白包被量为每孔0.1μg，单克隆抗体稀释2×106倍，用0.5%脱脂乳粉制备封闭液，酶标稀释液二抗稀释2×105倍．在pH 7.4环境下，该方法的灵敏度IC50为(22.16±1.77)μg/L，检测限 IC15为 (0.31±0.75)μg/L．胶体金免疫层析试纸条法的最优条件为：羊抗鼠二抗稀释20倍，N蛋白稀释10倍，用Sartorious公司CN95型号的NC膜，单克隆抗体添加量为3μL，碳酸钾溶液添加量为5μL，pH 7.4的PBS缓冲液作为上样缓冲液．该方法可视检测限(vLOD)为62μg/L，临界值为500μg/L，可在10min左右测出结果．两种免疫学方法对SARS-CoV-2的N蛋白进行快速检测，可作为核酸检测的重要辅助手段.