张 峰,汪 麟,周明明,杨贤燕,苟中入

(1.浙江大学医学院附属儿童医院 口腔科/国家儿童健康与疾病临床医学研究中心,浙江 杭州 310003；2.浙江大学医学院附属第一医院 口腔科,浙江 杭州 310009；3.浙江大学医学院附属儿童医院 实验检验中心、国家儿童健康与疾病临床医学研究中心,浙江 杭州 310003；4.浙江大学 浙江加州国际纳米技术研究院,浙江 杭州 310058)

1 前 言

骨髓炎是由金黄色葡萄球菌感染导致骨组织的进行性吸收和破坏的疾病[1-2]。骨髓炎的根治措施包含清除细菌,清理感染坏死组织,骨和软组织重建[3]。但由于致病微生物耐药性差异,治疗具有挑战性。而且,越来越多的耐药细菌菌株、植入物相关感染以及免疫系统受损等均会加剧骨髓炎症状[4]。此外,通过手术清除感染和坏死组织后常常留下较大的死腔。为了防止骨髓炎复发和可能导致严重骨丢失,常使用抗生素复合于聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)充填骨腔隙。由于抗生素释放剂量受到这种高分子骨水泥包埋的限制或者抗生素降解,以及PMMA 需再次手术等原因,预后仍有较大的不可预知性。因此,持续有效地控制骨感染和骨创伤修复仍然是难以协同解决的问题。

硫酸钙(calcium sulfate,CS)作为人工骨充填材料最早应用于人体的报道始于1892年[5]。CS拥有理想骨植入材料的诸多优点,譬如能促进骨组织形成,减少术区炎症反应[6]；CS和细胞外间质在骨愈合早期可以协同促进血管生成和骨重建[7]。但在生物活性方面,纯CS材料只能提供成骨细胞生长所需钙离子,并不能显著提升骨再生能力[8]。近年来,随着生物材料科学的发展,有学者利用微量元素的掺杂改善了人工骨修复材料的生物学性能。

锶(strontium,Sr)作为人体骨代谢必需的微量元素和细胞代谢过程的调节因子,在许多包括细胞信号传导、核酸合成、骨重建等生物过程中起到重要作用。Sr能够调节骨骼内钙浓度和骨代谢,促进骨再生,以及增强骨密度并降低骨质疏松病人骨折发生率。体外实验也证实,Sr具有促进成骨细胞增殖和抑制破骨细胞活性的作用[9-11]。Sr掺杂的羟基磷灰石已被证明能显著抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长的功效[12]。同时,Sr掺杂还抑制了其他离子的释放,能够降低材料的降解速率[13-14]。

据此,围绕CS自固化生物材料的研究现状及临床应用中的不足,本实验提出通过Sr掺杂来调控CS晶体的形态,并以不同Sr掺杂剂量水平优化CS材料的降解性及其生物学效应。本研究将改进CS材料的综合性能,并拓展该材料在骨感染再生修复领域的应用前景。

2 实 验

本研究通过共沉淀法合成了掺杂不同比例微量元素Sr的半水CS植入材料,探索了不同掺Sr含量水平半水CS水化后力学强度、可塑性、体外降解性能和诱导磷灰石矿化活性,进而系统分析了不同掺Sr水平CS对金黄色葡萄球菌模型的抑制能力,旨在优化设计并构建一类具有优良综合性能的新型促进感染骨再生修复掺Sr半水CS生物活性材料。

2.1 掺Sr半水CS粉体的制备

通过化学共沉淀法制备掺Sr半水CS(CS-xSr；x=0,2.5,5,10)[15]。按Sr/(Ca+Sr)摩尔比分别为0,2.5%,5%,10%将Ca O 和Sr(NO3)2配置成复合物,利用超声振荡器将该复合物均匀分散在去离子水中。按(Ca+Sr)/S摩尔比1∶1将(NH4)2SO4配置成水溶液,用恒流泵将(NH4)2SO4水溶液滴定到CaO和Sr(NO3)2的混合溶液物中,25 ℃恒温下连续搅拌,直到反应完成(图1)。对反应溶液中的沉淀物进行抽滤,用去离子水和无水乙醇洗涤3次,去除杂质离子,在80 ℃干燥24 h,将该粉体在行星式球磨机中以250 r/min转速球磨6 h,135 ℃恒煅烧12 h,80 ℃干燥4 h,最后将粉末研磨和筛分。

图1 四种不同Sr掺杂半水CS的制备方法示意图Fig.1 Schematic illustration of the preparation method of strontium-doped calcium sulfate hemihydrate

2.2 测试与表征

对粉体样品采用扫描电子显微镜(SEM,Ultra 55)观察其微结构,采用X 射线衍射(XRD,Max RC)分析测试样品粉体的物相组成,采用电感-火焰等离子体发射光谱法(ICP-OES,iCAP 6000 series)测试粉体中Sr、Ca的含量。

2.3 体外降解实验

以0.8 m L/g的液固比将去离子水和适量粉体样品均匀混合,调和成糊状物,以2 MPa的压强将糊状物压制成尺寸为ϕ8 mm×15 mm 的圆柱体,常温下初步固化1 h制备出自固化圆柱体样品。然后将该样品放入37 ℃恒温箱中静置,24 h后称其初始质量Wo。再将该自固化圆柱体样品密闭浸泡在37 ℃的Tris缓冲液中,待分别静置1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d后取出,60 ℃恒温箱静置4 h彻底干燥后分别称其质量Wt。计算圆柱体固化物样品的失重=[(WoˉWt)/Wo]×100%,每个样品重复测量3次。

2.4 机械性能分析

按第2.3节方法制备圆柱体样品,将其在37 ℃恒温箱中静置24 h后,转移到37 ℃的Tris缓冲液中密闭浸泡7 d,然后将其干燥,使用1 mm/min运行速率的万能测试机(Instron)测量浸泡前后四种样品的抗压强度,每个样品重复测量3次。

2.5 模拟体液浸泡实验

按第2.3节方法制备尺度为ϕ8 mm×2 mm 的圆片状样品,在37 ℃恒温箱中静置24 h,再将样品密闭浸泡在37 ℃的SBF溶液中,待分别浸泡1 d、3 d、7 d后进行乙醇漂洗脱水和90 ℃恒温箱中静置6 h干燥,采用SEM 观察样品表面的微结构特征。

2.6 抑菌实验

选用金黄色葡萄球菌(ATCC25923,购自美国菌种收藏中心),通过最低抑菌浓度实验和直接接触实验来测试四种样品的抑菌性能。将ATCC25923培养过夜至对数生长期,然后用无菌Mueller-Hinton(MH)肉汤调整至0.5 MCF左右。

2.6.1 最低抑菌浓度 (minimum inhibitory concentration,MIC) 按照CLSI M07-A9 微量稀释肉汤法测定四种不同粉体样品的最低抑菌浓度。首先,挑取培养过夜的处于对数生长期的细菌,用无菌MH 肉汤调至初始浓度约为5.0×105CFU/m L 的菌液。将四种粉体样品做系列倍比稀释后,CS、CS-2.5Sr、CS-5Sr和CS-10Sr粉体的最终浓度分别为32、16、8、4、2、1和0.5 mg/m L。阴性对照管(NC)不添加细菌悬液,仅MH 肉汤；阳性对照管(PC)含有细菌悬浮液但不添加任何样品粉体。在37 ℃下培养16～24 h后读取MIC,MIC是指肉眼所见抑制细菌生长的最低浓度。

2.6.2 直接接触实验(direct contact test,DCT) 针对培养过夜的处于对数生长期的细菌,用无菌MH肉汤调至0.5 MCF左右(～108CFU/m L)的菌液。将细菌与亚抑菌浓度(1/2 MIC)的待测粉体样品混合,总体积为1.0 m L。所有培养物在37 ℃,200 r/min的摇床中培养。分别在培养1 d和3 d时进行菌落计数。菌落计数方法:用移液器取0.1 m L培养液,用0.85% NaCl进行一系列的10倍稀释,取0.01或0.1 m L 适当浓度的稀释液接种在营养琼脂平板上。37 ℃培养18～24 h后进行菌落计数。

3 实验结果

3.1 形貌观察和微结构分析

表1是CS、CS-2.5 Sr、CS-5Sr和CS-10Sr四种粉末的ICP结果。从表可见,四种粉体Sr实际掺杂率分别为0、2.51%、5.48%和9.67%,接近合成前的理论值0、2.5%、5%和10%。

表1 四种不同掺锶水平半水硫酸钙材料各离子理论和实际摩尔占比Table 1 Molar ratio in the reactants and chemical compositions in the CS and Sr-doped CS powders %

图2是四种粉体的XRD 分析结果。从图可见,掺Sr后的半水CS粉末分别在14.75°、25.71°、29.76°和31.91°/2θ处有四个强特征峰。同时,纯CS粉体的特征峰比Sr掺杂CS 粉体的峰特征更加明显(JCPDS#41-0224)。此外,从Sr掺杂的半水CS粉体XRD 图谱中还可以发现SrSO4的特征峰(JCPDS#05-0593),尤其是CS-5Sr和CS-10Sr两种粉体中SrS的衍射特征峰更加明显,表明这种共沉淀法制备的Sr掺杂半水CS实为两相复合粉体材料,Sr掺杂率提高会导致粉体中SrS含量增加。

图2 四种不同Sr掺杂半水CS粉体样品的XRD图谱Fig.2 XRD patterns of CS and CS-x Sr powders

图3是CS-xSr四种粉体的SEM 图像。从图可见,CS-xSr四种粉体颗粒物呈棒状,颗粒表面较光滑,颗粒平均长度为20～50μm。其中在CS-5Sr和CS-10Sr两种粉体颗粒表面还可以观察较为细小的针状晶体,并且CS-10Sr中该细小针状晶粒明显多于CS-5Sr,不难可以推测这种针状晶体可能是SrS。

图3 四种不同Sr掺杂半水CS粉体材料的表面形态照片Fig.3 SEM images of CS and CS-x Sr powders(a1、a2:CS:b1、b2:CS-3.5Sr；c1、c2:CS-5Sr；d1、d2:C5-10Sr)

3.2 体外降解性能分析

图4显示了四种自固化CS-xSr样品在Tris 溶液中浸泡1～28 d后的体外降解情况。从图4A 可以发现,1～3 d内纯CS样品Ca2+释放最快,而CS-10Sr样品Ca2+释放最慢；3 d后CS-10Sr样品Ca2+释放最快,而纯CS样品Ca2+释放最慢。从图4B可以看出CS-xSr样品Sr2+释放量随着浸泡时间的延长而逐渐增多,Sr含量高的样品同一时间点Sr2+释放最多；图4C显示了四种CS-xSr样品在Tris溶液中浸泡1～28 d后质量衰减情况,可以发现,1～3 d内纯CS样品质量下降最显著,而CS-10Sr样品质量下降最少；但3 d后CS-10Sr样品质量下降多于其他样品,而纯CS样品质量下降则最少。

图4 四种不同Sr掺杂率半水CS自固化在Tris-HCl溶液中Ca2+(A),Sr2+(B)离子浓度以及失重率(C)的变化情况Fig.4 Changes in Ca2+(A),Sr2+(B)concentrations and weight loss(C)of the self-curing CS-x Sr sample during immersion in Tris-HCl buffer

3.3 机械性能分析

图5显示了四种CS-xSr样品在体外降解7d前后的抗压强度差异情况。结果发现,自固化样品在Tris-HCl溶液中浸泡降解前的抗压强度明显大于浸泡降解7 d后的。浸泡前纯CS样品的抗压强度(～24 MPa)明显低于三种掺Sr的样品；随着Sr掺杂率从2.5%增加到10%,自固化物样品的抗压强度也逐渐增加。但各样品在体外浸泡降解7 d后的抗压强度都发生了显著下降。不过,纯CS样品浸泡后的抗压强度(～20 MPa)明显高于掺Sr的三种样品,同时Sr掺杂率从2.5%增加到10%时,其抗压强度显著下降,CS-10Sr的抗压强度仅有13.187 MPa,下降幅度达到2.8倍以上。

图5 四种不同Sr掺杂率半水CS自固化样品降解前和降解7天后的抗压强度Fig.5 Compressive strength of CS-x Sr(x=0,2.5,5 and 10)specimens before soaking and after soaking 7 days

3.4 体外生物活性分析

图6显示了四种CS-xSr样品在SBF溶液中浸泡1～7 d后样品表面形貌变化。从图可见,浸泡1 d后,四种样品的表面出现细小的纳米团聚颗粒；浸泡3 d后,四种样品表面可以观察到大量相互交错的条状纳米微粒,微粒直径在60 nm 左右,长度在300～400 nm左右；浸泡7 d后,条状微粒变得粗大,相互之间的结构更为致密,尤其是CS-10Sr样品表面基本被条状微粒覆盖。EDX 分析浸泡7 d的条状微粒,其Ca/P 比值均在1.57～1.78,预示各种样品发生了仿生矿化反应,从而出现了含钙酸盐组分。

图6 四种不同Sr掺杂率半水CS自固化样品在SBF溶液中浸泡1、3、7天后材料表面形貌变化Fig.6 Low(bar:20μm)and high(bar:5μm)magnified SEM images of the CS-x Sr specimens after soaking in SBF for 1 day,3 days and 7 days

3.5 抑菌性能分析

图7(a)通过最小抑菌浓度法显示了四种粉体对金黄色葡萄球菌的相对抑菌活性。可以发现,纯CS、CS-2.5Sr、CS-5Sr三种粉体对金黄色葡萄球菌的MIC值为8 mg/m L,CS-10Sr粉体MIC 值为4 mg/m L,显然CS-10Sr粉末对金黄色葡萄球菌具备更强的抑菌性能。图7(b)通过直接接触试验显示了四种CS-xSr粉体样品对金黄色葡萄球菌的抑菌性能。相比对照组,四种CS-xSr粉体样品显示出较强的抑菌活性。与纯CS 粉体相比,CS-2.5Sr、CS-5Sr和CS-10Sr三种粉体对金黄色葡萄球菌的抑制作用更为明显,而且CS-10Sr粉体表现出对金黄色葡萄球菌最强的抑制作用。以上结果表明,CS中掺杂Sr能够增强并延长抑菌效应。

图7 四种不同Sr掺杂半水CS粉体抗菌实验。(a)对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC,mg/m L)；PC,阳性对照；NC,阴性对照；(b)对金黄色葡萄球菌的直接接触实验(DCT,CFU/m L)Fig.7 Antibacterial activities of the CS-xSr the specimens against S.aureus with MIC(a)and DCT(b)at different time intervals

4 实验讨论

CS作为一种人工骨填充修复材料拥有悠久的历史[5]。虽然CS具有理想生物材料的诸多优点,但是该材料存在降解速率较快导致成骨活性相对较低[16]、抗感染能力较差[17]等缺点,严重阻碍了其在临床上的应用。因此,减缓材料的吸收速率、改善材料的成骨活性、增强材料的抑菌能力成为诸多研究者所关注的热点。Sr2+能够减弱骨吸收和促进新骨形成[18]。迄今含Sr化合物在临床上已广泛用于治疗骨质疏松症[19]。Liu等[20]报道Sr通过激活TGF-beta/Smad信号通路和下游转录因子Runx2能够促进骨缺损修复。因此,本实验通过共沉淀法制备出一种新型Sr掺杂的抗感染CS生物材料,以期提高骨替代材料的再生修复效果,缩短骨髓炎患者的愈合周期。

本研究将CaO、Sr(NO3)2等材料通过共沉淀反应制备出Sr掺杂半水CS粉体。四种粉体通过XRD检测发现,半水CS的主要特征峰清晰可辨,并在含Sr样品的XRD 图谱中的24.78o/2θ处可见SrS的衍射特征峰[21]；结合ICP 检测,证实了所制备的粉体为掺Sr半水CS与SrS的复合材料,且掺杂Sr2+不影响半水CS晶体的特有形态。通常,采用机械混合等方式也可制备类似的两相复合物,但是通过化学共沉积法制备较低含量SrS的半水CS 材料,势必可以达到两相更为均匀复合,避免因第二相局部富集使得半水CS水化性能和局部力学性能受到影响。

通常理想的骨替代材料不仅需要与新骨形成速度相匹配的降解速率,还需要具备一定的骨组织力学支撑能力。从四种不同Sr掺杂半水CS样品的力学强度及衰变情况可见,少量针状纳米SrS组分分散于半水CS水化固化物中,将有助于提升固化物的初始致密性,从而产生良好的力学增强效应,因而SS-10Sr固化后其抗压强度显著高于纯半水CS的固化物。不仅如此,在降解的最初阶段(1～3 d),掺Sr越高的固化物因其内部更为致密的结构,使得降解速率慢于纯半水CS固化物。但是,随着针状SrS组分逐步降解,将造成两相复合固化物的内部结构变得更为疏松,不仅导致其力学强度更为显著地下降,还因其微结构疏松及比表面积增大,使得其降解速率加快,从而出现固化物的质量更为快速下降的现象。由此可见,随SrS组分含量增加,将增加固化物的结构致密性,从而抑制固化物在最初阶段的降解性。但是,因固化物降解而使得其结构疏松并导致后期的降解加快。通常,SrS掺杂会影响无机材料的成核和结晶行为[22-23]。CaO 和Sr O 都是材料晶体网络基本结构,但是Sr2+的原子半径更大且Sr—O 键更弱,降低了某些无机盐材料晶体网格之间的粘性[23]。因此可以预测,在降解的后期阶段,固化物Ca2+的释放量大于不含Sr2+的半水CS固物化,这一变化同时也影响到了四种材料力学强度的变化。

众所周知,骨髓炎进展过程中会分泌大量的炎性物质,进而导致病患区呈酸性环境,引起材料降解速度加快、抑制金黄色葡萄球菌能力下降[24]。在SBF 浸泡实验中,掺Sr的CS-xSr表面形成了更多的纳米羟基磷灰石,而羟基磷灰石呈碱性,可以平衡部分酸性炎性产物,因此这种酸碱度稳定的微环境更有利于成骨细胞的长入、抑制破骨细胞引起的骨吸收、抑制细菌的生长[18,25-26]。Chang等[27]发现生物材料掺Sr后能够增加成骨细胞迁移、上调成骨标志基因的表达,并增加矿化结节的面积,尤其是掺杂10%Sr的材料在骨缺损区形成了更多的新骨。在抑制金黄色葡萄球菌实验中,含Sr的CS-xSr的抑菌作用明显强于纯CS,掺CS-10Sr最低抑菌浓度为4 mg/m L明显低于其他组。有学者发现Sr具有较强的抗菌能力,能够拮抗金黄色葡萄球菌的生长[28]。但也有学者发现Sr本身的抗菌能力较弱,Sr代替Ca能够改变材料的Zeta电位从而提高了抗菌活性[12]。因此,Sr的掺杂提升了CS自固化材料的生物活性和抗菌性,显示出优于临床其他材料的综合性能。

5 结 论

本实验的研究结果表明,微量元素Sr能够通过化学共沉淀法掺杂入半水CS 中并形成CS-xSr与SrS的两相复合物,通过不同Sr掺杂水平能调控CS的降解性和力学性能,还可实现不同水平的仿生矿化活性及抗菌性能,从而优化CS生物材料的各项生物学性能。因此,利用化学共沉淀法构建的掺Sr半水CS(即CS-xSr与SrS复合物)有望改善传统CS材料的降解性、生物活性和抗菌性,有助于推动骨髓炎抗感染和骨再生修复临床治疗技术的进步。