严春俊，郭川川，李般程，马钤，潘发琼，冷观雪

四川天味食品集团股份有限公司（成都 610200）

花椒（Zanthoxylum bungeamumMaxim）果实因其特有的香味和麻味，在食品烹饪和食品加工行业被广泛用作辛辣调味料。在中国，花椒有近三千年的栽培和利用历史，种植面积和产量均居世界第一[1-2]。花椒果皮中富含精油、生物碱、麻素和多酚类化合物等多种生物活性物质，这些物质具有抗氧化、抗菌和抗炎的作用，并可以减轻学习和记忆活动障碍[3-5]。

在实际应用中，花椒粉碎是普遍存在的，花椒适当的粉碎有利于香气成分的散出，而粉碎粒度越细，植物细胞破碎程度越高，油腺中的挥发油更容易挥发，从而损失越多[6-7]。不同粉碎设备因工作原理不同，在工作时机械本身的产热亦不同，使得花椒处于不同的环境温度下，可能导致花椒的品质发生变化。有研究指出，羟基-α-山椒素在室温下放置24 h其含量下降近70%，干燥温度50 ℃时，羟基-α-山椒素含量减少一半，60 ℃时几乎完全丧失，说明羟基-α-山椒素可能对温度极为敏感[3,8]。

在实际生产企业应用中，大多是利用常规粉碎设备处理花椒，设备工作温度最高可达60 ℃以上，使得花椒的麻素和挥发油的含量显著减少，在同等麻素条件下，这无疑会增加花椒的使用量，导致原料成本大幅增加，而低温粉碎设备由于其能控制粉碎温度，对花椒的麻素和挥发油含量影响较小，相比大多数企业采用的常规粉碎方式来说，能减少花椒粉的使用量，从而降低原料使用成本，为生产企业带来巨大的经济效益。

试验采用低温、恒温、常规粉碎3种粉碎方式分别对青花椒进行粉碎。考察粉碎温度对花椒的色泽品质、酰胺类化合物、精油、黄酮类化合物和多酚类化合物含量的变化情况，以及花椒粉的抗氧化活性，旨在为花椒粗加工企业提供更多的参考依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青花椒（云南昭通青花椒）。

芦丁、没食子酸（碧云天生物技术有限公司）；羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、羟基-γ-山椒素、羟基-ε-山椒素（成都埃法生物科技有限公司）；甲醇、Folin-Ciocalteu试剂、Na2CO3、AlCl3（成都市科隆化学品有限公司）。

1.2 主要仪器与设备

高速冷冻离心机（5804R，美国Thermo公司）；手持分光色差仪（CM-700D1，日本柯尼卡美能达公司）；制冷恒温摇床（欧若仪器有限公司）；紫外可见分光光度计（UV1800，日本岛津仪器公司）；电子天平（JA2003，海能科技有限公司）；高效液相色谱仪（LC-20，岛津国际贸易有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 花椒粉碎

取3个批次生产的青花椒各3袋，每袋10 kg，用低温、恒温和常规粉碎设备对青花椒进行粉碎，过孔径0.600 mm（30目）网筛，用PE袋取过筛网下的花椒粉各500 g，置于4 ℃储存。3种粉碎设备粉碎花椒时物料温度分别8～13，29～35和58～63 ℃，为便于分析描述，在后文中表述为10，30和60 ℃。

1.3.2 花椒粉色度的测定

利用手持色差仪，经黑白板校正后，对样品池中的花椒粉进行色泽测定，记录L*（亮度）、a*（红/绿）和b*（黄/蓝）值[9]，以未粉碎的花椒为对照。

1.3.3 花椒精油的制备

按照Jing等[10]的方法并适当修改。称取20 g花椒粉置于圆底烧瓶中，加入300 mL蒸馏水，摇匀后恒温水浴（100 ℃）加热2 h，冷却至室温，记录精油体积，重复3次。

1.3.4 提取液的制备

按照Tao等[11]的方法并适当修改。分别称取1 g 3种花椒粉置于50 mL离心管中，加入20 mL 70%甲醇，混合均匀。将离心管放置于摇床中振荡1 h，温度30 ℃，转速220 r/min，用冷冻离心机离心提取液30 min，温度25 ℃，转速10 000g，收集上清液，储存4℃备用，3种提取液分别命名为Q10，Q30和Q60。

1.3.5 紫外-可见光谱的测定

以70%甲醇溶液将提取液稀释200倍，利用紫外可见分光光谱仪测定波长在200～600 nm紫外-可见光谱。

1.3.6 总酰胺类物质含量的测定

按照Tao等[11]的方法并适当修改。将提取液适当稀释后，用紫外可见光谱仪测定波长268 nm处的吸光值，以羟基-α-山椒素绘制标准曲线，计算总酰胺类物质的含量（mg/g花椒粉）。

1.3.7 HPLC定量分析酰胺类物质含量

按照Zhu等[12]的方法并适当修改，流动相为乙腈-1%甲酸水（4∶6，V/V），色谱柱为赛默飞C18柱（255 mm×4.6 mm，5 μm），检测波长268 nm，流速1 mL/min，进样量10 μL，柱温30 ℃。标准品分别为羟基-α-山椒素，羟基-β-山椒素，羟基-γ-山椒素，羟基-ε-山椒素。

1.3.8 总多酚类物质含量的测定

采用福林酚法测定总多酚的含量，按照Jing等[10]的方法并适当修改。取100 μL样品或者标准品与750 μL 700 mmol/L的Na2CO3溶液混合，静置2 min，加入用ddH2O稀释至10%的福林酚溶液750 μL，静置30 min后，用紫外可见光谱仪检测波长765 nm处的吸光值。以没食子酸为标准品，标曲范围为0.062 5～1.5 mmol/L，根据标曲计算总多酚含量（mg GAE/g花椒粉）。

1.3.9 总黄酮含量的测定

按照Farhadi等[13]的方法并适当修改。取400 μL样品或者标准品与120 μL NaNO2（5%）混合反应5 min，加入120 μL AlCl3（10%）静置6 min，加入1 600 μL NaOH（4%），混合物避光静置25 min。用紫外可见光谱仪检测波长510 nm处的吸光值。以芦丁为标准品，标曲范围为0.125～2 mmol/L，根据标曲计算总黄酮含量（mg QE/g花椒粉）。

1.3.10 抗氧化活性

1.3.10.1 DPPH法

按照Blois[14]的方法并适当修改。将样品适当稀释，用甲醇配制DPPH溶液，浓度为200 μmol/L，现配现用。以ddH2O配制抗坏血酸为标曲，标曲范围为0～100 μmol/L。将样品或者标准品与DPPH溶液1∶1混合后，避光放置30 min后，用紫外可见光谱仪测定517 nm处的吸光值，抗氧化活性以抗坏血酸当量（mmol AAE/g花椒粉）表示。

1.3.10.2 ABTS法

按照Fan等[15]的方法并适当修饰。将样品适当稀释，用ddH2O配制7 mmol/L ABTS溶液与245 mmol/L过硫酸钾溶液，将ABTS溶液与过硫酸钾溶液100∶1混合后，过夜放置12～16 h，稀释50倍。以ddH2O配制抗坏血酸为标曲，标曲范围为0～1.2 mmol/L。将样品或者标准品与ABTS溶液1∶20混合后，避光放置30 min后，用紫外可见光谱仪测定734 nm处的吸光值，抗氧化活性以抗坏血酸当量表示（mmol AAE/g花椒粉）。

1.3.11 数据处理与分析

试验数据以均值±标准误差的形式表示，数据采用SPSS 19.0统计软件进行方差分析和显著性检验（P＜0.05），利用Origin 9.0作图。

2 结果与分析

2.1 色泽

花椒色泽是评价花椒品质的重要指标之一，不同粉碎温度下粉碎的花椒粉色泽如表1所示。结果显示，粉碎处理对花椒的色泽影响显著，与未粉碎花椒相比，花椒粉的L*值均明显增加，a*值与b*值均显著减小，说明花椒粉的亮度增加，绿色变深，黄色变浅，花椒粉整体处于浅绿色。

表1 不同粉碎温度对花椒色泽的影响

结果显示，粉碎温度30 ℃时花椒的色泽最深，不同粉碎温度下花椒粉的色泽并未随着粉碎温度的增加而增加，说明粉碎温度并不是影响花椒色泽的唯一因素，也可能与不同粉碎设备切割花椒时形成不同形状的花椒粉有关，由于光的反射，导致肉眼所见不同色泽的花椒粉。未粉碎花椒 - 42.77±0.57a-3.1±0.17d9.17±1.01d

花椒粉 10 45.10±1.08b-5.08±0.28c8.25±0.16c30 49.2±0.91d-7.28±0.13a5.60±0.37a60 47.02±0.91c-5.61±0.35b6.74±0.22b

2.2 紫外-可见光谱

采用紫外可见光谱检测花椒总酰胺类物质的文献中，检测波长略有不同，主要以256，270和275 nm为主[3,10,16]，为更加准确地检测总酰胺类物质的含量，对3种样品的紫外全谱进行检测，结果如图1所示。

图1 提取液紫外光谱图

不同样品的紫外光谱在波长268 nm出现明显的吸收峰，说明在此波长下检测酰胺类化合物含量更加准确。此外，粉碎温度越低，样品（a）在268 nm处的吸光值越强，说明酰胺类化合物的含量越高，即低温粉碎更能保留更多的酰胺类化合物。

不同样品在波长280 nm和330 nm也出现明显特征峰，这可能是由于样品中存在水溶性蛋白和多酚类或黄酮类物质[17]。

2.3 总酰胺类物质与精油含量

有研究指出，酰胺类化合物与精油对温度极其敏感[3]，故考察不同粉碎温度处理花椒后总酰胺类化合物和精油的含量，结果如图2（A）所示。结果显示，随着粉碎温度升高，总酰胺类化合物含量依次减少。粉碎温度60 ℃时，总酰胺类物质含量最低（32.2 mg/g），粉碎温度10 ℃时，总酰胺类物质含量可达到41 mg/g，是粉碎温度为60 ℃的1.27倍，说明粉碎温度对酰胺类化合物含量影响极大，在高温下，酰胺类化合物容易发生异构、水解和氧化反应。

精油得率如图2（B）所示。粉碎温度60 ℃时，精油得率最低（6.62 mL/100 g），其次是30 ℃（7.18 mL/100 g），粉碎温度10 ℃时，精油得率最高（8.42 mL/100 g）。这可能是因为低温粉碎设备在粉碎花椒过程中，低温保护相关油脂类化合物的降解和氧化[11]，与其他粉碎方式相比，获得更高的精油得率。

图2 总酰胺类化合物含量与精油得率

低温粉碎下总酰胺类物质和精油含量较常温粉碎要多，接近20%，在实际应用中，在同等麻素条件下，相当于原料的使用量减少20%，即节约原料成本近20%。

2.4 HPLC定量分析酰胺类物质

为更加清楚地了解花椒中酰胺类化合物的种类，以及粉碎温度对何种酰胺类化合物影响最大，采用HPLC对不同样品进行分析，结果如图3所示。结果显示，3个样品中在波长268 nm处均出现3个明显的吸收峰，分别为羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、羟基-ε-山椒素，与前人所报道的结果基本相[18-19]。

图3 标准品与样品HPLC图谱

将样品所测峰面积与标曲进行比较，计算羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、羟基-γ-山椒素和羟基-ε-山椒素，标曲信息如表2所示，计算结果汇总于表3。

表2 线性回归方程与线性范围数据

表3 样品中山椒素含量

结果显示，不同样品中羟基-α-山椒素的含量最高，其次为羟基-β-山椒素，最低为羟基-γ-山椒素，与已报道的文献[8]相同，但含量较前人报道的较低，这可能与花椒的品种有关。

不同粉碎温度下，羟基-α-山椒素与羟基-β-山椒素的变化趋势相同，均随温度的升高而降低，而羟基-γ-山椒素与羟基-ε-山椒素并未有较明显的变化，说明温度对羟基-α-山椒素与羟基-β-山椒素含量的影响最大。此外，粉碎温度10 ℃时，羟基-α-山椒素与羟基-β-山椒素含量最高，这也说明低温粉碎更有利于保留这2种山椒素。另外，有研究表明羟基-α-山椒素是最主要的诱发独特刺痛感（麻味）的化合物[20]。

2.5 总多酚与总黄酮含量

多酚与黄酮类化合物也是花椒中重要活性成分，具有多种生理活性，也有研究指出这2类化合物对花椒的色泽有影响[21-22]。

结果显示，不同样品中总多酚与黄酮类化合物的含量均随粉碎温度升高而减少，这可能是因为高温使得总多酚与黄酮类化合物的氧化程度和分解速率加快所致[23-24]。粉碎温度10 ℃时，总多酚类化合物含量为51.29 mg GAE/g，总黄酮类化合物含量71.39 mg QE/g，随着粉碎温度升高至60 ℃时，总多酚类化合物含量为38.92 mg GAE/g，总黄酮类化合物含量54.84 mg QE/g，这也说明低温粉碎更有利于保留更多的多酚与黄酮类化合物。

图4 多酚与黄酮类化合物含量图

2.6 抗氧化活性

花椒粉具有抗氧化活性是因为其含有多酚与黄酮类化合物，而这2类化合物对产品的保质期会产生一定影响[25]，因此，检测花椒粉的抗氧化活性是有必要的。

采用DPPH和ABTS法研究不同粉碎温度处理花椒后，花椒粉的抗氧化活性，结果如表4所示。不同粉碎温度处理对DPPH和ABTS的影响相似，随着粉碎温度升高，花椒粉的抗氧化活性均降低。粉碎温度10 ℃时，花椒粉对DPPH的清除能力为274.1 mmol AAE/g，对ABTS清除能力为348.68 mmol AAE/g，是粉碎温度60 ℃的1.36倍，这是因为低温粉碎使得花椒粉中总多酚与黄酮类化合物的含量较高所致。

表4 不同粉碎温度下提取液的抗氧化活性

3 结论与展望

试验结果为花椒的粉碎提供了有价值的理论知识。试验发现，不同粉碎温度对花椒的色泽品质及精油、酰胺类化合物、多酚与黄酮类化合的物含量均有显著影响。随着粉碎温度的升高，花椒中各类化合物成分均呈下降趋势，由于多酚与黄酮类化合物的减少，花椒粉的抗氧化活性也呈现下降趋势。对酰胺类化合物进行HPLC分析发现，不同样品中羟基-α-山椒素含量最高，其次为羟基-β-山椒素，最低为羟基-γ-山椒素。随着粉碎温度升高，羟基-α-山椒素与羟基-β-山椒素的含量均降低，而羟基-γ-山椒素与羟基-ε-山椒素并未有较明显的变化，说明温度对羟基-α-山椒素与羟基-β-山椒素的含量影响最大。

总的来说，低温粉碎时，精油8.42 mL/100 g、总酰胺类物质41 mg/g、总多酚类化合物51.29 mg GAE/g，总黄酮类化合物71.39 mg QE/g的含量均达到最高水平，表明在低温下粉碎有利于花椒中活性成分与风味成分的保留。

试验对不同粉碎温度下青花椒活性成分含量变化情况进行研究，但未研究不同粉碎温度下青花椒粉在产品中的应用，后续可在此基础上开展相关研究，结合感官评价方法探究青花椒粉在产品中的应用。