盖永强，蓝天婵，张乐宏，郑卓琦，朴美子，李岩

青岛农业大学食品科学与工程学院（青岛 266109）

枸杞属茄科落叶灌木，主要产于我国河北和宁夏，是一种传统的名贵中药材[1]，枸杞果肉中含有枸杞多糖、维生素、酚类、生物碱和黄酮等多种活性成分[2-3]。研究发现，枸杞多糖是枸杞提取物中最主要的功能成分，有降血糖、降血压、抗氧化、抗衰老、提高免疫力等生物学功能[4-7]。黄芪，又名绵芪、绵黄芪，主要分布于我国西北、华北和东北等地区，具有很高的药用价值。黄芪多糖是黄芪的主要成分之一，大量研究表明，黄芪多糖具有免疫调节、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、降血脂等功能[8-12]。

多糖是由10个以上的单糖分子通过糖苷键连接而成的天然高分子化合物[13]。据研究报道，植物多糖的提取方法有多种，例如热水浸提法、超声波辅助提取法、酸碱水解提取法、酶法提取法等[14-17]。植物多糖作为一种生物活性大分子物质，在维持人体机能、提高人体免疫力、抗肿瘤、抗菌消炎、降低血糖等方面发挥着重要的作用[18-21]。因此，提高多糖的提取率对枸杞和黄芪资源的开发具有重要意义。

该试验主要利用加热、超声波、生物酶等多种辅助手段提取红、黑枸杞黄芪混合物中的多糖，筛选出提取率最高的提取方法，为药用植物多糖的生产提供有效的数据支撑和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

红枸杞、黑枸杞、黄芪（购自青岛大润发超市）；果胶酶、纤维素酶、苯酚、浓硫酸、葡萄糖（由实验室提供）。

1.1.2 仪器与设备

XF-20C粉碎机（青岛海泰生物技术有限公司）；WFZUV-2000紫外可见分光光度计（美国贝克曼公司）；HH-4A水浴锅（常州国华电器有限公司）；KQ-600DE超声波清洗器（昆山舒美超声仪器有限公司）；AR1140电子天平（上海奥豪斯仪器有限公司）；TGL-16M高速台式冷冻离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）；DZF-6050真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；LYOQUEST-55冷冻干燥机（西班牙Telstar公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理

将烘干后的红枸杞、黑枸杞和黄芪分别置于粉碎机中粉碎成粉末，分别按照1∶1质量比将枸杞与黄芪混合，得到红枸杞黄芪和黑枸杞黄芪2种混合物粉末。

1.2.2 枸杞黄芪复合粗多糖的提取方法

1.2.2.1 传统提取法

分别准确称取红枸杞黄芪混合物和黑枸杞黄芪混合物，按照1∶10（g/mL）料液比添加蒸馏水，搅拌均匀置于45 ℃水浴锅中热水浸提70 min，浸提液经纱布过滤后，滤液在3 500 r/min，4 ℃条件下离心15 min，将上清液冷冻干燥得到红枸杞黄芪复合粗多糖和黑枸杞黄芪复合粗多糖。同理，将水浴锅温度设置成85 ℃，按照上述方法处理，得到85 ℃下提取的红枸杞黄芪复合粗多糖和黑枸杞黄芪复合粗多糖。将45℃和85 ℃下传统提取方法分别用T-45和T-85表示。

1.2.2.2 超声波提取法

分别准确称取红枸杞黄芪混合物和黑枸杞黄芪混合物，按照1∶10（g/mL）料液比添加蒸馏水，搅拌均匀后进行超声波处理70 min，超声温度设置45 ℃，超声功率350 W，工作频率80 kHz。料液经纱布过滤后，滤液在3 500 r/min，4 ℃条件下离心15 min，将上清液冷冻干燥得到红枸杞黄芪复合粗多糖和黑枸杞黄芪复合粗多糖。将超声提取方法用U表示。

1.2.2.3 酶提取法

（1）胶酶提取

分别准确称取红枸杞黄芪混合物和黑枸杞黄芪混合物，按照料液比1∶10（g/mL）添加蒸馏水，加入质量比0.4%的果胶酶搅拌均匀，置于45 ℃水浴中酶解70 min，料液经纱布过滤后，滤液在3 500 r/min，4 ℃条件下离心15 min，将上清液冷冻干燥得到红枸杞黄芪复合粗多糖和黑枸杞黄芪复合粗多糖。将果胶酶提取方法用P表示。

（2）纤维素酶提取

分别准确称取红枸杞黄芪混合物和黑枸杞黄芪混合物，按照料液比1∶10（g/mL）添加蒸馏水，加入质量比0.4%的纤维素酶搅拌均匀，置于45 ℃水浴中酶解70 min，料液经纱布过滤后，滤液在3 500 r/min，4 ℃条件下离心15 min，将上清液冷冻干燥得到红枸杞黄芪复合粗多糖和黑枸杞黄芪复合粗多糖。将纤维素酶提取方法用C表示。

（3）果胶酶与纤维素酶联合提取

分别准确称取红枸杞黄芪混合物和黑枸杞黄芪混合物，按照料液比1∶10（g/mL）添加蒸馏水，加入质量比0.2%的果胶酶和0.2%的纤维素酶搅拌均匀，置于45 ℃水浴中酶解70 min，料液经纱布过滤后，滤液在3 500 r/min，4 ℃条件下离心15 min，将上清液冷冻干燥得到红枸杞黄芪复合粗多糖和黑枸杞黄芪复合粗多糖。将果胶酶与纤维素酶联合提取方法用PC表示。

1.2.2.4 超声波提取法和酶法联合提取法

（1）超声波与果胶酶联合提取

分别准确称取红枸杞黄芪混合物和黑枸杞黄芪混合物，按照料液比1∶10（g/mL）添加蒸馏水，加入质量比0.4%的果胶酶搅拌均匀后进行超声波处理70 min，超声温度设置45 ℃，超声功率350 W，工作频率80 kHz。料液经纱布过滤后，滤液在3 500 r/min，4 ℃条件下离心15 min，将上清液冷冻干燥得到红枸杞黄芪复合粗多糖和黑枸杞黄芪复合粗多糖。将超声波与果胶酶联合提取方法用UP表示。

（2）超声波与纤维素酶联合提取

分别准确称取红枸杞黄芪混合物和黑枸杞黄芪混合物，按照料液比1∶10（g/mL）添加蒸馏水，加入质量比0.4%的纤维素酶搅拌均匀后进行超声波处理70 min，超声温度设置45 ℃，超声功率350 W，工作频率80 kHz。料液经纱布过滤后，滤液在3 500 r/min，4℃条件下离心15 min，将上清液冷冻干燥得到红枸杞黄芪复合粗多糖和黑枸杞黄芪复合粗多糖。将超声波与纤维素酶联合提取方法用UC表示。

（3）超声波、果胶酶与纤维素酶联合提取

分别准确称取红枸杞黄芪混合物和黑枸杞黄芪混合物，按照料液比1∶10（g/mL）添加蒸馏水，加入质量比0.2%的果胶酶和0.2%的纤维素酶搅拌均匀后进行超声波处理70 min，超声温度设置为45 ℃，超声功率350 W，工作频率80 kHz。料液经纱布过滤后，滤液在3 500 r/min，4 ℃条件下离心15 min，将上清液冷冻干燥得到红枸杞黄芪复合粗多糖和黑枸杞黄芪复合粗多糖。将超声波、果胶酶与纤维素酶联合提取方法用UPC表示。

1.2.3 粗多糖的测定

将不同提取方法下冷冻干燥得到的18种红、黑枸杞黄芪复合粗多糖，分别称量并用式（1）计算得率。

粗多糖得率=w/W×100% （1）式中：w为提取液冷冻干燥后质量，g；W为提取前称取的红、黑枸杞黄芪混合物质量，g

1.2.4 多糖含量的测定

1.2.4.1 葡萄糖标准溶液的配制

准确称取50.0 mg（精确到0.1 mg）烘干的葡萄糖，加水溶解并定容至50 mL容量瓶，混匀，得到1.0 mg/mL的葡萄糖标准溶液。准确移取上述标准溶液，制成质量浓度分别为20，40，60，80和100 μg/mL的葡萄糖标准溶液。

1.2.4.2 标准曲线绘制

分别移取1.0 mL葡萄糖标准溶液于试管中，加入1.0 mL 5%苯酚溶液，然后快速加入6.0 mL浓硫酸，在室温放置30 min，以水为空白对照，用紫外可见分光光度计测定其在490 nm波长处的吸光度。以葡萄糖质量浓度（x）为横坐标，吸光度（y）为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.4.3 样品溶液的配制及测定

分别称取10 mg 9种提取方法得到的红枸杞黄芪复合粗多糖和黑枸杞黄芪复合粗多糖，加水溶解定容至100 mL容量瓶，摇匀，得到18种枸杞黄芪复合粗多糖溶液。移取1.0 mL样品溶液于试管中，加入1.0 mL 5%的苯酚溶液，然后快速加入6.0 mL浓硫酸，室温放置30 min，以水为空白对照，用紫外可见分光光度计测定其在490 nm波长处的吸光度，带入标准曲线方程中计算多糖含量。

1.2.5 精密度试验

按1.2.4.3小节的方法配制枸杞黄芪复合粗多糖溶液，分别吸取6份1 mL样液进行试验，利用苯酚-硫酸法测定样液，通过显色反应测定其在490 nm波长处的吸光度。通过比较6份样液的相对标准偏差（SRSD），考察不同提取方法的精密度。

1.2.6 稳定性试验

按1.2.4.3小节的方法配制枸杞黄芪复合粗多糖溶液，分别在室温放置0，1，2，3，4和5 h，利用苯酚-硫酸法测定不同时间段样液在490 nm波长处的吸光度。通过比较样液的相对标准偏差（SRSD），考察5 h内样品溶液的稳定性。

2 结果与分析

2.1 红、黑枸杞黄芪混合物中粗多糖的得率

由图1可知：在传统提取方法下，高温对黑枸杞黄芪复合物中粗多糖的提取影响较大；单一提取方法下，果胶酶提取较其他方法对红、黑枸杞黄芪复合物中粗多糖的提取效果较好；联合提取方法下，双酶提取和超声波与果胶酶提取效果较好，说明果胶酶对红、黑枸杞黄芪复合物中粗多糖的提取影响较大。

图1 不同提取方法下红、黑枸杞黄芪混合物中粗多糖得率

2.2 粗多糖中多糖含量

按1.2.4.2小节的方法绘制标准曲线，得线性回归方程：y=0.003 7x-0.005 5（R2=0.997 3）。根据回归方程求得18种粗多糖溶液中多糖含量。由图2可知，传统提取法和超声波提取方法提取的红、黑枸杞黄芪粗多糖中的多糖含量低于50%，单酶提取比果胶酶与纤维素酶联合提取的红、黑枸杞黄芪粗多糖中的多糖含量高，分别能达到94.33%和78.12%，说明果胶酶与纤维素酶联合使用能促使其他成分的溶出。超声波与酶法联合提取的红、黑枸杞黄芪粗多糖中的多糖含量相对较高，分别能达到86.33%和95.69%。

图2 不同提取方法下粗多糖溶液中多糖含量

2.3 红、黑枸杞黄芪混合物中多糖得率

由图3可知，传统提取法和超声波提取法提取的红、黑枸杞黄芪复合多糖得率较低，最高不到10%。果胶酶提取和纤维素酶提取要比双酶联合提取的红、黑枸杞黄芪复合多糖得率高，说明双酶联合提取不如单酶提取效果好。超声波与酶法联合提取方法中，超声波与果胶酶联合提取红、黑枸杞黄芪复合多糖得率最高，分别能达到23.29%和18.77%。

图3 不同提取方法下红、黑枸杞黄芪混合物中多糖得率

2.4 精密度

6份样液显色反应后，对490 nm波长处的吸光度进行分析，其吸光度的相对标准偏差（SRSD）在0.21%～0.97%之间，说明该方法精密度良好。

2.5 稳定性

枸杞黄芪复合粗多糖溶液在室温放置0，1，2，3，4和5 h后，通过显色反应，对490 nm波长处的吸光度进行分析，其吸光度的相对标准偏差（SRSD）小于1.1%，说明该方法在5 h内测定是稳定的。

3 结论

以红枸杞、黑枸杞和黄芪原料，制备红枸杞黄芪混合物与黑枸杞黄芪混合物，通过多种方法提取红、黑枸杞黄芪混合物中的复合粗多糖，利用苯酚硫酸法测定其中多糖的含量并进行比较，最佳提取方法为超声波与果胶酶联合提取法，即0.4%果胶酶、超声波处理70 min、超声温度45 ℃、超声功率350 W、工作频率80 kHz，多糖得率分别为23.29%和18.77%，比传统提取法提高634.7%和463.7%。因此，超声波与果胶酶联合提取是一种有效提取多糖的方法。