马士辉，凌飞海，许宇光，郭子柏，桂安萍，陈 怡

（1. 广东省中山市人民医院乳腺中心，广东 中山 528403；2. 广东省中山市人民医院超声影像科，广东 中山 528403）

乳腺癌是临床中常见的恶性肿瘤，发病率有逐年升高的趋势[1]。新辅助化疗作为一种全身治疗手段，在乳腺癌的综合治疗中占据着越来越重要的地位，临床上常用乳腺彩超、钼靶、核磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）等辅助检查评估新辅助化疗是否有效，这些影像学检查往往不能及时、早期的反应新辅助化疗的疗效[2-3]。血清CA153、CA125、CEA因其灵敏性、特异性均比较低，在监测新辅助化疗疗效的应用中作用有限[5-7]。随着超声技术的不断发展，利用超声造影技术评估乳腺癌原发病灶在经过新辅助化疗前后的血流灌注变化来预测新辅助化疗的效果具有较好的可行性[8-9]。循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）是从原发肿瘤脱落后进入到人体血液循环的肿瘤细胞，其有助于反应患者体内肿瘤细胞的情况，并且CTCs的变化明显早于影像学的变化。多种肿瘤患者体内都可监测到CTCs，并且CTCs的数目与患者的临床分期、预后及肿瘤的复发转移密切相关[10-11]。本研究联合不同的检测指标来综合评价新辅助化疗的疗效临床具有可行性，以期为临床判断新辅助疗效提供更多选择。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择本院2020年1月－12月确诊为临床分期III期的乳腺癌患者80例为研究对象，女性，年龄36～68岁，平均年龄（48.9±14.3）岁，浸润性导管癌患者44例，浸润性小叶癌患者23例，大汗腺癌患者9例，黏液腺癌患者4例；绝经前患者43例，绝经后患者37例。纳入标准：患者均经病理学证实，且有明确的可测量转移病灶；预期生存者超过3个月；依从性好。排除标准：并发有其他恶性肿瘤患者；无法耐受化疗或靶向治疗患者；1个月内进行过手术患者。本研究中患者均知情同意，并经医院伦理委员会批准。

1.2 治疗方法

患者均接受4×EC（表柔比星90 mg·m-2+环磷酰胺600 mg·m-2）→4×T（多西他赛75 mg·m-2）新辅助治疗（根据分子分型可联合靶向治疗）。分别在第1次、第3次和第5次化疗前通过流式细胞术来进行外周血CTCs计数，并通过超声造影测量乳腺原发肿瘤具有活性部分的大小。

1.3 CTCs计数

抽取7.5 mL研究对象外周静脉血进行CTCs检测，操作过程严格按照说明书进行CTCs计数。将抽取到的外周静脉血转移至15 mL锥形管中（cell research试剂盒），加入6.0 mL试剂盒配套缓冲液，充分混匀后4 000 rpm离心10 min。采用Celltracks Autoprep检测样本中的CTCs检测，采用 Celltracks Analyzer II软件判定 CTCs（CTCs为CK+ADPI+CD45-）。在患者进行第1次、第3次和第5次化疗前通过流式细胞术来进行外周血CTCs计数。

1.4 超声造影仪器与方法

采用GE Logic 9超声诊断仪，线阵探头频率9.0 MHz，造影剂采用声诺维（意大利Bracco公司）。识别目标病变后，把探头置于稳定位置，把成像模式切换到低机械指数的特定造影成像模式，实施双幅显像，机械指数设置（0.06～0.08），获得足够的组织抑制并保持足够的深度穿透力。声诺维25 mg与0.9%氯化钠注射液5 mL配置成混悬液，造影剂以团注的方式进行注射并用5～10 mL生理盐水冲洗。造影剂注射开始录像，观察病灶内微泡造影剂的走形及分布，动态采集图像2 min，图像存盘待脱机分析。

1.5 敏感度和特异度

敏感度=真阳性数/（真阳性数＋假阴性数）×100%，用于判断有病而被正确诊断的百分比；特异度=真阴性数/（真阴性数＋假阳性数）×100%，用于判断无病而被诊断无病的百分比。

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0 进行数据分析。计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验。以P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 化疗对乳腺癌患者CTCs的影响分析

在第1次、第3次和第5次化疗前，患者的CTCs阳性率分别为62.50%（50/80）、55.00%（44/80）和38.75%（31/80），第5次化疗前的CTCs阳性率远低于第1次、第3次化疗前（P＜0.05）。

2.2 化疗对乳腺癌患者CA153、CA125和CEA的影响比较

与第1次前相比，第3次化疗前CA153、CA125和CEA水平无明显变化（P＞0.05），而第5次化疗前上述指标明显降低（P＜0.01），见表1。

表1 化疗对乳腺癌患者CA153、CA125和CEA的影响比较（±s，n= 80）

表1 化疗对乳腺癌患者CA153、CA125和CEA的影响比较（±s，n= 80）

注：与第1次化疗前比较，## P＜0.01

时间 CA153/（U·mL-1）CEA/（ng·mL-1）第1次化疗前 47.65±6.93 201.31±23.25 95.62±16.48第3次化疗前 45.63±6.64 194.57±21.98 90.87±15.59第5次化疗前 41.23±4.36## 96.89±16.45##64.36±12.43##CA125/（U·mL-1）

2.3 临床病理因素与CTCs的关系分析

研究发现，ER和PR等病理状态与CTCs阳性率无相关性（P＞0.05），Her2和Ki67等病理状态与CTCs阳性率密切相关（P＜0.01），见表2。

表2 临床病理因素与CTCs的关系分析（n= 80） 例

2.4 循环肿瘤细胞联合超声造影预测乳腺癌新辅助化疗疗效分析

研究证实，循环肿瘤细胞联合超声造影预测乳腺癌新辅助化疗疗效的敏感度、特异度和准确度明显高于循环肿瘤细胞或超声造影预测乳腺癌新辅助化疗疗效（P＜0.01），见表3。

表3 循环肿瘤细胞联合超声造影预测乳腺癌新辅助化疗疗效分析（n= 80） 例（%）

3 讨论

乳腺癌已成为威胁女性生活质量和生存状态的恶性肿瘤之一，其发病率有逐年升高的趋势。新辅助化疗对中期乳腺癌患者后续接受手术和放疗等治疗措施十分关键[12-13]。因此，目前多项研究都在寻找合适的适用于临床的肿瘤标志物来帮助乳腺癌的早期诊断、预后判断及指导乳腺癌的个体化治疗。在新近研究热点中，某些肿瘤标志物例如循环肿瘤细胞（CTCs）和循环肿瘤DNA（ctDNA）得到了学者广泛重视。在乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌等转移的预测价值上，CTCs计数水平越高提示术后局部复发或远处转移的风险越高[14-16]。乳腺癌患者出现远处转移的前提是外周血液中出现CTCs，CTCs的检测对乳腺癌的早期诊断、监测疗效及预后判断都具有重要意义。本研究证实，在第1次、第3次和第5次化疗前，患者的CTCs阳性率差异显著，且循环肿瘤细胞联合超声造影预测乳腺癌新辅助化疗疗效的敏感度、特异度和准确度明显高于循环肿瘤细胞或超声造影预测效果，表明循环肿瘤细胞联合超声造影对预测乳腺癌新辅助化疗疗效具有重要参考价值。

外周血中CTCs计数与乳腺癌患者的临床分期、分子分型及预后是否相关，目前不同的试验得出的结果不一致，有试验结果提示CTCs计数与乳腺癌患者临床病例特征及预后相关，但也有资料显示CTCs的检出与肿块大小、淋巴结状态及激素受体情况均无明显相关性。动态监测晚期乳腺癌患者的CTCs变化，具有实时指导治疗的价值。血清肿瘤标志物，如血清CA153、CA125、CEA因其灵敏性、特异性均比较低，在监测新辅助化疗疗效的应用中作用有限[17-19]。本研究证实，与第1次前相比，第3次化疗前CA153、CA125和CEA水平无明显变化，至第5次化疗前上述指标才明显降低，而在第1次、第3次和第5次化疗前，患者的CTCs阳性率差异显著，提示在预测新辅助化疗效果时CTCs较肿瘤标志物CA153、CA125和CEA更有效。

在乳腺癌早期CTCs就可能进入血液进而发生其他部位的播散转移，是乳腺癌患者的独立预后因素。鉴于CTCs在肿瘤研究中的重要作用，2007年，ASCO建议将CTCs作为一种新的肿瘤标志物，因而成为当前研究的热点。循环肿瘤细胞与肿瘤的分期、预后有一定的关系，但是因为循环肿瘤细胞在外周静脉血液中很稀少，阳性率不高，依靠单一的循环肿瘤细胞计数来判断新辅助化疗的疗效可能准确性有限。超声造影在临床中更多的是应用在判断肿瘤良恶性方面。彩色多普勒超声在乳腺肿瘤中的应用具有重要作用。超声造影因为可以反映肿瘤活性病灶大小，在判断新辅助化疗前后病灶大小具有广阔的应用前景。超声造影在显示病灶血流灌注强度上优于二维超声，可直接反映微循环下肿瘤的大小、形态，对肿瘤内部的液化坏死区较敏感，通过判断是否存在充盈缺损以及充盈缺损的面积，可评估化疗效果或指导临床制定治疗方案[20-22]。本研究证实，循环肿瘤细胞联合超声造影预测乳腺癌新辅助化疗疗效的敏感度、特异度和准确度分别为95.0%、95.0%和96.3%，明显高于循环肿瘤细胞或超声造影预测乳腺癌新辅助化疗疗效。

综上所述，循环肿瘤细胞联合超声造影对预测乳腺癌新辅助化疗疗效具有重要参考价值。在以后的工作中，我们将进一步增大纳入的样本量，探讨循环肿瘤细胞联合超声造影对预测乳腺癌新辅助化疗疗效的价值，以期为临床制定乳腺癌治疗方案提供依据。