张金媛，顾银银，葛玲玲，李立文

（1.张家港第一人民医院针灸康复科，江苏 张家港 215600；2.张家港第一人民医院中医科，江苏 张家港 215600；3.张家港市中医医院针灸科，江苏 张家港 215600）

失眠是指入睡困难、睡眠中途易醒、睡眠时间减少或睡眠质量低下，对日常工作和生活会造成不同程度的影响[1]。目前，临床常用镇定类药物进行治疗，短期内有效，但长期治疗效果尚未得到证明，镇定类药物会对记忆、反应能力带来一定的影响，同时患者会对镇定类药物产生一定的依赖性[2]。研究[3-4]表明，针灸在治疗失眠的过程中既有良好的疗效，且不良反应方面具有独特的优势，但其作用机制尚不明确。失眠与机体免疫能力下降有关，且TLR/NF-κB通路是介导免疫功能的重要通路，因此推测电针对失眠症的调控作用与TLR/NF-κB通路有关。内关作为八脉交会穴，能宁心安神、宽胸理气，具有主治疗失眠等相关病症的功效[5]。本研究建立失眠症大鼠模型，对双侧内关进行电针，探究电针通过调控TLR/NF-κB通路对失眠症大鼠的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级、SD雄性大鼠，6周龄，体质量175～230 g，平均（200±15） g，购于南京医科大学，许可证为[生产许可SCXK（苏）2021-0001]。

1.2 主要材料与仪器

氯苯丙氨酸（PCPA）购于上海易恩化学技术有限公司；NaOH和HCL溶液购入西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；安定注射液（地西泮）（国药准字H62020554，甘肃兰药药业集团有限责任公司）；TNF-α、sTNF-RⅡ酶联免疫试剂盒购于上海酶联生物科技有限公司；FITC标记F4/80单抗，PE标记TLR3、TLR4单抗均购于北京百奥莱博科技有限公司；总RNA提取试剂盒购于爱必信（上海）生物科技有限公司；TRIzol试剂盒、逆转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒均购于上海恪敏生物科技有限公司；兔抗大鼠MyD88、TAB2、NF-kB一抗、山羊抗兔二抗均购于北京百奥莱博科技有限公司。

华佗牌SDZ-Ⅱ电子针疗仪及一次性无菌针灸针（规格：0.25 mm×25 mm）均购于苏州医疗用品厂有限公司；酶联免疫以检测仪（型号：BIOBASE1001，济南来宝医疗器械有限公司）；流式细胞仪[型号：CytoFLEX，贝克曼库尔特国际贸易（上海）有限公司]；美国伯乐高压电泳仪（型号：Powerpac HV，上海奥陆生物科技有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 大鼠模型建立及分组 根据失眠动物造模法[6]进行模型建立，即氯苯丙氨酸（PCPA）造模法，用NaOH和HCL水溶液，将42 mL生理盐水调至pH为7.8左右的弱碱性溶液，取1.25 g PCPA，用配置好的弱碱性溶液配制为混悬液（300 mg·kg-1），每日1次，连续腹腔注射2 d。当第1次注射28～30 h后，大鼠昼夜节律消失，而对照组大鼠昼夜节律正常，即大鼠失眠模型建立成功。

选用40只雄性大鼠，随机选取10只为对照组，不作处理，其余大鼠均成功建立失眠模型，并随机分为模型组，安定组及电针组，每组10只。

1.3.2 药物处理 建模成功后，根据人与大鼠的体质量及给药剂量换算公式[7]，安定组腹腔注射安定注射液（地西泮）0.92 mg· kg-1·d-1；电针对双侧内关进行针刺，设置电针仪参数为电流强度2 mA，频率2/15 Hz，留针20 min，隔日1次，均连续治疗15 d共8次；对照组与模型组腹腔注射等量的生理盐水。

1.3.3 酶联免疫法检测大鼠血清肿瘤坏死因子α（TNF-α）、可溶性人肿瘤坏死因子受体Ⅱ（sTNF-RⅡ）水平 治疗后，对大鼠进行麻醉处理，腹腔注射40 mg· kg-1，2%戊巴比妥钠，采集5 mL腹主动脉血，室温静置2 h，4 000 rpm低温（4℃）离心10 min，取上清液。根据酶联免疫试剂盒说明书，将标准品配制不同的浓度，并加入上清液50 μL，混匀后依次加入酶标记物，显色剂进行显色，最终加入终止液，使反应终止，采用酶联免疫检测仪检测TNF-α、sTNF-RⅡ测光密度值，根据标准曲线计算待测样浓度。

1.3.4 流式细胞术检测大鼠脾脏CD4+、CD5+调节性T细胞（Treg） 采集血液后处死，取出脾脏，每组5只大鼠脾脏研磨后制成脾细胞混液。取部分脾脏细胞悬液，离心（1 500 rpm，5 min）后弃上清液，加入200 μL溶血剂混匀，温水浴（40℃）15 min，离心后弃去上清液，冲洗2遍，加入PBS缓冲液，制备1×108·mL-1细胞悬液。吸取10 μL样本加入流式管，分别加入FITC标记CD4单抗与PE标记CD25单抗各5 μL；冰浴30 min，冲洗后用流式细胞仪进行检测。

1.3.5 流式细胞术检测大鼠脾脏单核细胞表面TLR3、TLR4 取制备好的1×108·mL-1脾脏细胞悬液10 μL，分别加入FITC标记F4/80单抗，PE标记TLR3、TLR4单抗各5 μL，冰浴30 min后冲洗；分别加入TLR3、TLR4单抗，冰浴30 min后冲洗。采用流式细胞仪对脾脏单核细胞表面TLR3、TLR4进行检测。

1.3.6 Western Blot检测大鼠脾脏MyD88、TAB2、NF-kB蛋白相对表达水平 另5只大鼠脾脏迅速置于液氮中保存，取50～100 mg冷冻保存的脾脏组织，研磨成匀浆，用裂解液对脾脏组织进行裂解，测定脾脏组织的蛋白浓度。采用电泳仪进行电泳，分离目的蛋白质，转膜后进行1 h封闭，根据一抗说明书进行稀释，分别加入MyD88、TAB2、NF-kB及内参一抗、二抗，进行孵育，最后经显影得到结果。（蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值÷β-Actin 灰度值）[8]。

1.3.7 RT-PCR检测大鼠脾脏TLR3、TLR4、MyD88、TAB2、NF-kB mRNA表达情况 取50～100 mg冷冻保存的脾脏组织，根据TRIzol试剂盒说明书提取脾脏总RNA，并检测总RNA的纯度及浓度，以总RNA为模板，逆转录得到cRNA。取2μLcDNA，与20μL反应体系中进行扩增（2 μL SYBR，上、下游引物各1 μL，纯水加至20 μL）；PCR扩增条件：预变性95 ℃，10 min，变性95 ℃，10 s，退火延伸，60 ℃，34 s，扩增40个循环[9]。以β-actin为内参，引物序列见表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.4 统计学方法

用SPSS 22.0软件分析数据，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，多样本计量资料比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清TNF-α、sTNF-RⅡ水平比较

见表2。

表2 各组血清TNF-α、sTNF-RⅡ水平比较（±s，n= 70）

表2 各组血清TNF-α、sTNF-RⅡ水平比较（±s，n= 70）

注：与对照组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与安定组比较，▲P＜0.05

组别 TNF-α/（pg·mL-1 ） sTNF-RⅡ/（ng·mL-1 ）对照组 81.67±9.28 1.21±0.31模型组 102.68±12.82# 2.23±0.59#安定组 90.42±9.47#△ 1.75±0.42#△电针组 82.35±10.13△▲ 1.23±0.34△▲

2.2 各组脾脏CD4+ Treg、CD4+CD25+ Treg比较

见表3。

表3 各组脾脏CD4+、CD4+CD5+ Treg比较（±s，n = 10） %

表3 各组脾脏CD4+、CD4+CD5+ Treg比较（±s，n = 10） %

注：与对照组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与安定组比较，▲P＜0.05

组别 CD4+ Treg CD4+CD25+ Treg对照组 4.58±0.93 1.31±0.11模型组 2.46±0.41# 4.03±0.01#安定组 3.64±0.56#△ 2.33±0.05#△电针组 4.97±0.87△▲ 1.40±0.07△▲

2.3 各组脾脏单核细胞表面TLR3、TLR4表达情况比较

见表4。

表4 各组脾脏单核细胞表面TLR3、TLR4表达情况比较（±s，n= 10）

表4 各组脾脏单核细胞表面TLR3、TLR4表达情况比较（±s，n= 10）

注：与对照组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与安定组比较，▲P＜0.05

组别 TLR3 TLR4对照组 386.18±25.34 316.57±22.11模型组 524.46±35.71# 468.43±31.61#安定组 425.64±31.56#△ 367.13±26.65#△电针组 395.97±26.63△▲ 323.41±23.21△▲

2.4 各组脾脏MyD88、TAB2、NF-kB蛋白表达情况比较

见表5、图1。

表5 各组脾脏MyD88、TAB2、NF-kB蛋白表达情况比较（±s，n= 10）

表5 各组脾脏MyD88、TAB2、NF-kB蛋白表达情况比较（±s，n= 10）

注：与对照组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与安定组比较，▲P＜0.05

组别 MyD88 TAB2 NF-kB对照组 1.43±0.24 1.88±0.27 0.87±0.07模型组 3.21±0.35# 3.61±0.34 3.67±0.21#安定组 2.37±0.24#△ 2.11±0.30 2.59±0.14#△电针组 1.51±0.28△▲ 1.64±0.24 0.80±0.08△▲

图1 各组脾脏MyD88、TAB2、NF-kB蛋白免疫印迹

2.5 各组脾脏TLR3、TLR4、MyD88、TAB2、NF-kB mRNA表达情况比较

见表6。

表6 各组脾脏TLR3、TLR4、MyD88、TAB2、NF-kB mRNA表达情况比较（±s，n= 10）

表6 各组脾脏TLR3、TLR4、MyD88、TAB2、NF-kB mRNA表达情况比较（±s，n= 10）

注：与对照组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与安定组比较，▲P＜0.05

组别 TLR3 mRNA TLR4 mRNA MyD88 mRNA TAB2 mRNA NF-kB mRNA对照组 0.97±0.07 0.98±0.05 0.95±0.06 1.03±0.05 1.04±0.07模型组 2.07±0.66# 2.25±0.52# 1.45±0.27# 2.24±0.31# 3.01±0.74#安定组 1.27±0.21#△ 1.19±0.19#△ 1.21±0.23#△ 1.07±0.25#△ 1.56±0.34#△电针组 0.90±0.18△▲ 0.87±0.21△▲ 1.06±0.22△▲ 0.81±0.31△▲ 1.17±0.29△▲

3 讨论

失眠的作用机制复杂，研究证实，针灸对于神经递质具有一定的调节作用，通过调节中枢神经，从而改善睡眠[10]。炎症细胞水平受到心情、疼痛等精神状态的影响，有研究[11]显示在抑郁症患者的炎症因子水平异常，IL-6、TNFα水平明显升高。另外失眠还会影响机体的免疫功能，但其作用机制尚不明确。NGF/TrkA通路是介导炎症反应与免疫作用的重要通路，因此推测电针对于失眠症的调节可能与NGF/TrkA通路有关[12]。目前对于NGF/TrkA通路在失眠症中的研究较少，本研究通过建立失眠症大鼠模型，探究电针对该通路的调节作用[13]。

TNF的表达受到昼夜节律的影响，参与睡眠的调节，相关研究[12]表明，向家兔脑或静脉注射TNF，能够延长其睡眠时间。TNF-α与其他因子共同激活免疫反应，sTNF-R为TNF-α受体，能够反应TNF-α的活性[13]。本研究中模型组TNF-α、sTNF-RⅡ水平升高，即失眠症会促进机体炎症反应的发生，而安定注射液及电针会使机体TNF-α、sTNF-RⅡ水平，降低机体炎症反应。其中电针的效果更明显，使炎症因子恢复至正常机体水平。CD4+CD25+Treg能够直接反应机体的免疫情况，正常状态下，CD4+CD25+Treg能够维持机体的免疫耐受，防止机体过免疫，而非正常状态下，CD4+CD25+Treg或导致机体出现免疫抑制，降低T细胞的增殖能力，导致机体免疫能力下降，相反CD4+Treg在炎症存在的情况下，则具有抑制炎症的作用[14]。本研究中模型组CD4+Treg占比降低，而CD4+CD25+Treg占比升高，说明在失眠的状态下，机体处于炎症状态，免疫力降低，而经过西药治疗或电针治疗后，CD4+Treg占比升高，而CD4+CD25+Treg占比降低，表明机体炎症减少，免疫能力提高，提示药物治疗与电针治疗均有一定作用，其中电针效果更明显。

当机体受到外界细菌或病毒入侵时，机体会激活免疫系统抵抗病原体的入侵，也可通过炎症反应，激活细胞因子杀死病原体[15]。有研究[16]证实，受到外界感染时，会引起发热和促进睡眠，睡眠能够对免疫细胞与细胞因子的活性造成一定影响，睡眠与机体的免疫功能与炎症反应存在某种联系。MyD88依赖型是TLR/NF-κB通路的经典途径，该途径中NF-κB被激活，并与TNF-α与IL-1β的启动子结合，激活机体的免疫系统，调节炎症反应[17]。研究结果显示，模型组TLR3、TLR4、MyD88、TAB2、NF-kB mRNA及MyD88、TAB2、NF-kB蛋白表达均上调，表明失眠或激活TLR/NF-κB通路，引起炎症反应TNF-α、sTNF-RⅡ等分泌升高，同时导致CD4+Treg占比降低，而CD4+CD25+Treg占比升高，机体免疫能力下降。本研究大鼠经过电针治疗后，TLR3、TLR4、MyD88、TAB2、NF-kB mRNA 及 MyD88、TAB2、NF-kB蛋白表达下调，TLR/NF-κB通路受到抑制，提示电针双侧内关穴能够抑制TLR/NF-κB信号通路，降低炎症反应，提高机体免疫能力，从而缓解失眠的症状，改善睡眠。