朱富平，刘红强，常 清，冷伟业 (重庆市第九人民医院普外一科，重庆 400700)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是严重威胁人类健康的消化系统恶性肿瘤之一[1]。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是HCC发生最主要的流行病学因素，80%以上的HCC患者存在HBV感染史[2]。因此，临床亟需寻找评估HBV-HCC发生发展和预后的可靠预测因子和潜在治疗靶点。外泌体是一类小的、包含大量蛋白质、脂质和核酸等的细胞外囊泡，是细胞间重要的信号通讯工具[3-4]。有研究证实，肿瘤细胞分泌的miR-222-3p可在循环外泌体中富集，促进上皮性卵巢癌[5]、非小细胞肺癌[6]等肿瘤的恶性发展。Li等[7]研究发现，HBV感染衍生的外泌体可通过抑制Akt/mTOR通路促进病毒复制，这与miR-222-3p的高表达有关。Sun等[8]也证实HBV感染进一步促进了miR-222-3p的表达，并通过miR-222-3p介导的THBS1下调促进HCC的进展。因此，我们推测血清外泌体miR-222-3p有望成为HBV-HCC诊断中的非侵入性生物标志物，然而目前尚缺乏相关的临床证据。基于此，本研究通过分析HBV-HCC患者血清外泌体miR-222-3p表达水平及与患者临床特征和预后的相关性，以期为寻找可靠的生物标志物和改进临床治疗策略提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集2012年1月至2017年11月我院普外科收治的604例HCC患者的临床病理资料，包括391例HBV-HCC患者(男242例，女149例，年龄38～89岁)和213例非HBV-HCC患者(男135例，女78例，年龄40～88岁)。纳入标准:经病理检查证实为HCC，符合《原发性肝癌诊疗规范(2019年版)》[9]诊断标准；首次确诊，既往未行任何相关抗癌治疗；HBV-HCC患者HBV表面抗原(HBV surface antigen，HBsAg)检测呈阳性，非HBV-HCC患者无慢性HBV感染史；具有完整临床、实验室、影像学相关资料。另选取288例慢性乙肝患者作为HBV组，患者有HBV感染史，HBsAg检测呈阳性。排除标准:丙型肝炎病毒或其他病毒性肝炎感染史；合并其他恶性肿瘤；有肝切除术、远处转移、肝动脉化疗栓塞术、肿瘤消融或抗病毒治疗史；心、肺、肾等器官严重功能障碍；自身免疫性疾病；合并其他感染性疾病；代谢、精神疾病；妊娠或哺乳期育龄患者；非原发病灶。本研究经我院伦理委员会批准(2012003)，所有患者及家属均对本研究知情，并签署书面知情同意书。

1.2 观察指标

收集所有患者的一般资料，包括年龄、性别、Child-Pugh分级、巴塞罗那临床肝癌(Barcelona clinic liver cancer，BCLC)分期、治疗方法等，以及生化资料。采集所有患者清晨空腹静脉血5 mL置于抗凝管中，于4 ℃下4 000 r/min离心15 min，分离血清，-80 ℃冰箱保存待测。采用酶联免疫吸附试验检测患者α-甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)、异常凝血酶原(des-gamma-carboxy prothrombin，DCP)水平，试剂盒均购自上海将来实业股份有限公司。采用日立7600-20全自动生化分析仪检测患者血小板计数(platelet count，PLT)、总胆红素(total bilirubin，TBil)、丙氨酸转氨酶(alanine aminotranseferase，ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、白蛋白(albumin，ALB)水平。采用SysmexCA-1500全自动血凝仪检测凝血酶原活动度(prothrombin activity，PTA)。所有检测均由对研究终点不知情的技术人员进行。

1.3 血清外泌体miR-222-3p检测

取0.5 mL血清样本于4 ℃下3 000 r/min离心10 min，使血细胞下降，然后12 000 r/min离心10 min，去除残留的细胞碎片。用全血清外泌体分离试剂盒(美国Invitrogen公司)从血清中分离纯化血清外泌体，并将外泌体颗粒重悬于磷酸盐缓冲液中，-80 ℃保存。取血清外泌体置于formvar涂层的铜—钯网格上，固定后用3%磷钨酸染色，通过100XCII透射电镜(日本JEOL公司)观察外泌体的大小和形态特征，并用NanoSight纳米粒径追踪分析仪确定外泌体颗粒粒径分布和相对浓度。采用Western blot法检测血清外泌体样本中CD63、TSG101、Alix表达，抗体均购自美国Abcam公司。用ExoQuick®外泌体提取和TRIzol试剂盒(美国Invitrogen公司)提取外泌体总RNA，通过PrimeScript RT试剂盒(日本Takara公司)进行反转录得到cDNA。逆转录后使用SYBR Green Real Time PCR试剂盒(日本Takara公司)在Applied Biosystems 7300型PCR系统上进行实时荧光定量PCR反应:95 ℃ 2 min，40个扩增周期(95 ℃ 30 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ 30 s)，每个周期后测量荧光曲线，平行进行3次。以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-222-3p的相对表达量。引物序列:miRNA-222-3p的正向引物序列为5’-CTCAGTAGCCAGTGTAG-3’、反向引物序列为5’-GAACATGTCTGCGTATCTC-3’；U6的正向引物序列为5’-ACAGATCTGTCGGTGTGGTGGCAC-3’、反向引物序列为5’-GGCCCCGGATTATCCGACATTC-3’。

1.4 随访

随访时间为第1年每3个月1次，第2年每4个月1次，第3年每6个月1次，之后每1年1次，随访的截止时间是2022年1月或者患者死亡时，记录患者死亡情况。定期检测患者肿瘤和HBV的血清标志物，并根据需要进行腹部造影、超声、肝动脉造影或侵袭性检查。总生存期定义为手术日期至随访截止时间或患者死亡时间。

1.5 统计学处理

使用SPSS 26.0软件处理数据，二分类变量以率(%)表示，采用χ2检验；连续变量先进行K-S正态性检验和方差齐性分析，文中所有连续变量均不符合正态分布，以中位数和四分位数表示，采用Mann-WhitneyU或Kruskal-WallisH检验。绘制受试者工作特征(receiveroperatingcharacteristic，ROC)曲线，并计算曲线下面积(areaunderthecurve，AUC)以评估血清外泌体miR-222-3p对HBV-HCC的诊断价值。采用Kaplan-Meier生存曲线和Log-rank检验分析miR-222-3p表达水平与患者预后的相关性。采用Cox比例风险回归模型分析影响HBV-HCC患者预后的危险因素。所有检验均为双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者一般资料比较

3组患者年龄、性别、ALB比较差异均无统计学意义(P>0.05)，而非HBV-HCC组和HBV-HCC组患者血清AST、ALT、TBil、AFP、DCP水平均高于HBV组，同时血清PTA、PLT显著低于HBV组(P<0.05)；HBV-HCC组和非HBV-HCC组患者Child-Pugh分级、BCLC分期、治疗方法比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 患者一般资料比较

2.2 血清外泌体获取及鉴定

用超速离心法从患者的血清中提取并纯化得到双层膜结构的球形或椭球型的外泌体，用透射电镜观察，颗粒分布均匀，粒径大小为40～100 nm。纳米粒径追踪技术显示，外泌体粒径主要为0～300 nm。经Western blot法检测，这些颗粒高表达CD63、TSG101、Alix，见图1。

a:纳米粒径追踪分析法分析血清外泌体的大小分布；b:血清外泌体的透射电镜图；c:Western blot法检测血清外泌体特征蛋白CD63、TSG101和Alix表达图1 血清外泌体特征鉴定

2.3 血清外泌体miR-222-3p水平比较

HBV组、非HBV-HCC组和HBV-HCC组患者血清外泌体miR-222-3p水平分别为1.0(0.8,1.2)、1.4(1.0,1.7)、1.6(1.3,2.1)，差异有统计学意义(H=217.064，P<0.001)。HBV-HCC组患者血清外泌体miR-222-3p水平显著高于非HBV-HCC组和HBV组(P<0.001)。经ROC曲线分析，血清外泌体miR-222-3p用于HBV-HCC诊断(HBV-HCC组vs.HBV组、HBV-HCC组vs.非HBV-HCC组)的AUC分别为 0.817(95%CI:0.786～0.847)、0.672(95%CI:0.632～0.712),见图2。根据ROC曲线得到最佳截断值，当血清外泌体miR-222-3p≥1.4时，用于区分HBV-HCC和HBV的准确性为88.7%，阳性似然比为8；当血清外泌体miR-222-3p≥1.7时，用于区分HBV-HCC和非HBV-HCC的准确性为79.0%，阳性似然比为3.5。

a:HBV-HCC组 vs.HBV组；b:HBV-HCC组 vs.非HBV-HCC组图2 血清外泌体miR-222-3p诊断HBV-HCC的ROC曲线

2.4 miR-222-3p表达与HBV-HCC患者不同临床特征的关系

根据血清外泌体miR-222-3p中位值1.6将HBV-HCC患者分为高表达组和低表达组，血清外泌体miR-222-3p的表达与患者HBV-DNA拷贝、AST、DCP、BCLC分期有关(P<0.05)，而与患者年龄、性别、HBsAg、ALT、TBil、ALB、PTA、PLT、AFP、治疗方法、Child-Pugh分级无关(P>0.05)，见表2。

表2 血清外泌体miR-222-3p表达与HBV-HCC患者不同临床特征的关系[例(%)]

2.5 miR-222-3p水平与HCC患者预后的关系

对于HBV-HCC患者，血清外泌体miR-222-3p高表达组和低表达组中位生存时间分别为2.66年、4.14年，总生存率分别为32.8%(64/195)、35.7%(70/196)，经Log-rankχ2检验，差异有统计学意义(χ2=15.078，P<0.001)，见图3a。对于非HBV-HCC患者，血清外泌体miR-222-3p高表达组和低表达组中位生存时间分别为4.05年、3.37年，总生存率分别为34.8%(24/69)、41.0%(59/144)，经Log-rankχ2检验，差异无统计学意义(P>0.05)，图3b。

a:HBV-HCC患者；b:非HBV-HCC患者图3 Kaplan-Meier曲线

2.6 Cox回归分析影响HBV-HCC患者预后的危险因素

经单因素和多因素Cox比例风险回归模型分析，年龄较大、BCLC分期较晚及AST、TBil、ALB、AFP、血清外泌体miR-222-3p水平较高是影响HBV-HCC患者预后的独立危险因素(P<0.05)，见表3。

表3 Cox回归分析影响HBV-HCC患者预后的危险因素

3 讨论

HBV感染是HCC发生的原因之一，也是最严重和最普遍的慢性病毒感染，患者的预后通常较差[2]。因此，迫切需要寻找新的诊断或预后生物标志物和潜在的治疗靶点。本研究结果显示，HBV-HCC组的血清外泌体miR-222-3p水平较非HBV-HCC组和HBV组显著升高，其高表达与患者不良预后密切相关，提示miR-222-3p可作为HBV-HCC早期诊断或潜在治疗靶点的分子生物学指标。

外泌体是由包括癌细胞在内的大多数细胞分泌的小膜泡，其通过传递活性生物分子在调节细胞间通讯中发挥关键作用，从而影响肿瘤细胞生长、血管生成、转移和其他生物过程[3]。miRNA是一类长度约22个核苷酸的内源性非编码RNA，主要通过与mRNA 3’非翻译区结合并触发mRNA降解或翻译抑制来调节基因的表达[5]。外泌体中的miRNA相对稳定，可防止细胞外核糖核酸酶降解。因此，外泌体miRNA可作为各种恶性肿瘤诊断和预后的非侵入性生物标志物。血清外泌体高度富集miRNA，外泌体可以在细胞间转移miRNA，从而影响HCC细胞的增殖和转移。越来越多的证据表明，外泌体中miRNA的失调会导致HBV-HCC的发生和进展，如HBV-HCC患者血清miR-125b、miR122水平下调[10-11]，而miR-210-3p水平上调[12]，这些都可能成为HBV-HCC的候选生物标志物。本研究中，血清外泌体miR-222-3p在区分HBV-HCC和非HBV-HCC或HBV-HCC和HBV时具有较高的准确性，而且其高表达与HBV-HCC患者HBV-DNA拷贝、BCLC分期有关，说明HBV感染可能增强了miR-222-3p的表达，进而促进疾病进展。

有研究发现，miR-222-3p在各种肿瘤细胞中发挥调节作用，如miR-222-3p可促进肿瘤细胞迁移和侵袭，抑制细胞凋亡，并与肾细胞癌患者的不良预后相关[13]。吴俊艺等[14]发现，血清外泌体miR-222-3p在HCC中异常高表达，并与HCC患者的不良预后密切相关，但并未分析miR-222-3p与肝炎病毒感染的关系。一些基础研究显示，miR-222-3p过表达对肝癌细胞的生长有促进作用[15-19]。本研究结果显示，血清外泌体miR-222-3p的表达与非HBV-HCC组患者的预后无关，但是血清外泌体miR-223-3p表达与HBV-HCC患者BCLC分期有关，特别是在BCLC C分期(晚期)和D分期(终末期)患者中，miR-223-3p水平升高更为常见；Kaplan-meier生存分析也显示，HBV-HCC患者miR-222-3p高表达患者总生存率明显低于miR-222-3p低表达患者，且血清外泌体miR-222-3p水平升高是影响HBV-HCC患者预后的独立危险因素。以上结论说明miR-222-3p可能在HBV-HCC中起到促癌作用。以前的体外研究已经报道了miR-223-3p在HBV-HCC细胞中的作用，如Sun等[8]发现HBV可诱导miR-222-3p表达上调，而miR-222-3p又进一步通过直接结合THBS1 mRNA的3’非翻译区并充当其竞争性内源性RNA，上调THBS1促进HCC增殖并抑制细胞凋亡。Bandopadhyay等[16]鉴定了HBV感染中miRNAs差异性表达谱，证实外泌体miR-222表达增加。HBV X蛋白与HCC的发生有关，HBV X蛋白通过与p53的直接相互作用，调节细胞过程，如减少DNA修复和抑制p53介导的凋亡[17]。此外，据报道，HBV X蛋白可上调miR-222，而miR-222过表达直接导致肿瘤抑制基因和细胞周期调节因子p27的下调[18]，这也解释了本研究中血清外泌体miR-222-3p水平与HBV DNA拷贝呈正相关。因此，miR-222-3p可能是HBV-HCC良好的预后生物标志物。

综上，血清外泌体miR-222-3p与HBV-HCC的发生发展密切相关，是影响HBV-HCC患者预后的一个独立危险因素，血清外泌体miR-222-3p表达水平升高预示着HBV-HCC患者预后不良，因此，血清外泌体miR-222-3p可作为HBV-HCC早期诊断或治疗靶点的候选生物标志物。但本研究仍处于初步探索阶段，样本量较小且血清外泌体miR-222-3p在HBV-HCC中的潜在机制尚未阐明，具有一定局限性，仍需要更多的临床研究来进一步证实。