高渐飞， 周 玮， 刘 妮， 杨 艳

( 1. 贵州科学院/贵州省山地资源研究所， 贵阳 550001； 2. 贵州工业职业技术学院， 贵阳 550008； 3. 贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室， 贵阳 550014 )

黑老虎()又名冷饭团、布福娜、大叶五味子等，为多年生常绿木质藤本植物，南五味子属五味子科，分布于贵州、广西、云南等地。其根茎俗称大血藤，是一种重要的中药材，用于治疗胃肠溃疡、急性肠胃炎、风湿性关节炎、跌打肿痛等(国家中医药管理局，1999；舒永志等，2011)，由于具有抗氧化、抗肿瘤、抗HIV、保肝、调节血脂等作用(Puet al., 2008;Ban et al., 2009; 延在昊等，2013；Ma et al., 2014)，因此受到广泛关注。黑老虎药用部位除主要成分为木脂类和三萜类外，还有一些倍半萜类、甾体类和氨基酸等(舒永志等，2012)，总木脂素含量为0.93%～2.11%。目前，已从中分离得到南五味子素、冷饭团素、异戊酰基-日本南味子木脂素 A等70余种木脂素类化合物，绯红南五味子酮A和B、黑老虎酸等80余种三萜类化合物(舒永志等，2012；段林坪，2018；李力等，2020)。同时，倍半萜、甾体类化合物、原儿茶酸、香草酸等成分逐步被分离鉴定，挥发油中的主要成分(烯类、醇和烃类)也相继被检出(李昕等，2014；杨艳和高渐飞，2018)。

黄酮类化合物是药用植物的主要活性成分之一，具有重要的生物活性和药理作用，在药物和食品保健领域应用前景广泛(文开新等，2010；苏明媛等，2011；Roohbakhsh et al., 2015; 邹丽秋等，2016)。关于黑老虎药用和非药用部位的类黄酮多样性和丰度的代谢组学信息还鲜有报道。代谢组学通过高通量化学分析技术对生物样品中的小分子代谢产物进行定性和定量分析，能够直接反映生命体终端和表型信息，已应用于解析植物不同的阶段、组织、加工方式中物质的变化规律(钱瑞等，2019；孙伟丽等，2019；方贤胜等，2020；戴宇樵等，2020)。利用广泛靶向代谢组学方法，鉴定黑老虎植株叶、茎、根中的代谢物，根据其结构配置进行归类，解析黄酮类成分在不同部位的富集格局，旨在阐明叶和茎中与根类似或高度富集物质，为挖掘黑老虎的利用价值提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品的采集和提取方法

所用黑老虎为人工栽培，所处环境为80%遮阳网塑料大棚，位于贵阳市乌当区下坝镇普渡村，定期修剪管理、长势良好，栽培6 a，藤蔓已木质化。2020年7月29日，选3株长势较为接近的植株进行取样。用小铲子辅助刨开土壤，每株剪下2～3个主根及细根作为根部样品，2～3个地表以上约10 cm起的主蔓之一为其茎部，5～6片中下部长势较好的成熟叶片作为叶；分别用10 mL冻存管取3个重复，分别编号为KR1-3(根)、KS1-3(茎)和KL1-3(叶)；之后，迅速置于液氮中，随后转运到-80 ℃超低温冰箱保存备用。

将3组供试样品真空冷冻干燥，研磨仪(MM 400，Retsch)研磨(30 Hz，1.5 min)至粉末状；称取100 mg粉末，溶解于1.2 mL 70% 甲醇提取液中；每30 min涡旋一次，每次持续30 s，共涡旋6次，置于4 ℃冰箱过夜；离心(转速 12 000 r·min，10 min)后，吸取上清，用微孔滤膜(0.22 μm pore size)过滤样品，并保存于进样瓶中用于分析。

1.2 色谱质谱采集条件

采用高效液相-串联质谱(UPLC-MS/MS)对样本进行物质鉴定，液相条件如下。色谱柱：Agilent SB-C18 1.8 μm，2.1 mm × 100 mm；流动相：A相为超纯水(加入0.1%的甲酸)，B相为乙腈(加入0.1%的甲酸)；洗脱梯度： 0.00 min B相比例为5%，9.00 min内B相比例线性增加到95%，并维持在95% 1 min，10.00～11.10 min，B相比例降为5%，并以5%平衡至14 min；流速0.35 mL·min，柱温40 ℃，进样量4 μL。

利用AB4500 Q TRAP UPLC/MS/MS系统(配备了ESI Turbo离子喷雾接口)检测电喷雾离子源(ESI)，由Analyst 1.6.3软件(AB Sciex)控制运行(Xu et al., 2020)。ESI源操作参数：离子源，涡轮喷雾；源温度550 ℃；离子喷雾电压(IS)5 500 V(正离子模式)/-4 500 V(负离子模式)；离子源气体I(GS I)，气体Ⅱ(GS Ⅱ)和帘气(CUR)分别设置为50、60、25.0 psi，参数设置为高。

1.3 样本质控

质控(quality control，QC)样本由样本提取物混合制备而成，用于分析样本在相同的处理方法下的重复性。在仪器分析的过程中，每3个检测分析样本中插入一个质控样本，以监测分析过程的重复性。

1.4 数据分析

基于迈维(武汉)生物技术有限公司MVDB V 2.0 数据库和代谢物信息公共数据库，根据二级谱信息进行物质定性，之后用三重四极质谱多反应监测模式(MRM)定量。获得不同样本的代谢物质谱，对所有物质质谱峰进行峰面积积分，并对其中同一代谢物在不同样本中的质谱出峰进行积分校正(Fraga et al., 2010)。采用多元统计分析，对样本进行主成分分析(PCA)，正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)模型分析代谢组数据，进一步展示各分组之间的差异。OPLS-DA模型的预测参数及解读如Thévenot等(2015)和戴宇樵等(2020)所述。基于OPLS-DA结果，进一步参照差异代谢物筛选方法(戴宇樵等，2020)，按照：(1)选取fold change≥2 和fold change≤0.5 的代谢物为差异显著；(2)选取VIP≥1 的为差异显著。同时，将得到的相应差异代谢物(differentially accumulating metabolites, DAMs)提交到KEGG网站，进行相关通路分析。

2 结果与分析

2.1 样本质控及主成分分析

通过对不同质控QC样本质谱检测分析的MRM代谢物检测多峰图(多物质提取的离子流谱图，XIC)进行重叠展示分析，可以看到重复样本不同物质的离子峰值重叠性比较好(图1)，说明实验过程具有稳定性，检测结果可靠。

图 1 MRM代谢物检测多峰图Fig. 1 Multimodal diagram of MRM metabolite detection

通过对样本(包括质控样本)进行主成分分析，判别黑老虎的叶(KL1-3)、茎(KS1-3)、根(KR1-3)各样本组间和组内的变异度大小。全部样本 PCA得分图(图 2)结果显示，LC-MS分析所得原始数据在PC1、PC2两种主成分中得到良好呈现。由图2可知，第一主成分的贡献率为65.3%，第二主成分的贡献率为 26.6%，代表2个主成分能够基本反映检测样本的主要特征信息。3组样本在二维图上表现出明显的分离趋势，表明对各样本数据处理结果可信，各样本间存在明显差异。

图 2 样本 PCA 得分图Fig. 2 PCA score chart of samples

2.2 代谢物分析

经 LC-MS/MS 检测后，根据保留时间、质荷比及峰强的矩阵进行代谢物注释，鉴定出黑老虎根、茎、叶中代谢物，基于其结构配置进行分类。其中，黄酮类化合物有85个，叶、茎和根中分别含有80、73和67个，3个部位均有61个相同的黄酮类化合物(表 1)。进一步将检出的类黄酮分类，包括查耳酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇、黄酮、黄酮醇、黄酮碳糖苷和黄烷醇类7类，其中以黄酮和黄酮醇占主导，占总数的54.1%；二氢黄酮醇和黄酮碳糖苷最少，分别为1个和2个。叶和茎中黄酮醇分别为34个和31个，远高于根中的22个，黄酮碳糖苷和黄烷醇类数量相同，其余类数量较接近(图3)。这表明黄酮醇数量分布不均是造成3个部位类黄酮总数差异的主要原因。

表 1 黑老虎根、茎和叶中黄酮类成分Table 1 Flavonoid compounds in roots, stems and leaves of Kadsura coccinea

续表1

续表1

通过离子流强度累计，叶中类黄酮离子流强度24.00 × 10、茎中13.45 × 10、根中9.05 × 10，含量分别为22.8%、15.6%和8.8%，呈现连续大幅度下降趋势。其中，黄酮醇在茎、根中持续向下表达最为显著，黄酮也明显下调，二者分别是所在部位类黄酮成分富集量最主要的贡献者(另外是黄烷醇类和查尔酮) (图3)。由此可知，黑老虎叶、茎、根中类黄酮富集量差异显著，其主要受黄酮醇和黄酮积累模式(向下或向上)的影响。

图 3 黑老虎根、茎和叶中黄酮类代谢物数量分布Fig. 3 Quantitative distribution of flavonoid metabolites in roots, stems and leaves of Kadsura coccinea

2.3 差异代谢物筛选分析

为了鉴别出具体有哪些DAMs造成了分离现象，建立黑老虎叶与茎(KL vs KS)、叶与根(KL vs KR)、茎与根(KS vs KR)之间的3 组OPLS-DA 模型。3组比较OPLS-DA得分结果显示， 模型具有很好的预测能力和可靠性，能够很好地表现各组间代谢物的变化趋势；对OPLS-DA 模型进行200次排列验证，<0.05模型最佳(表2)，可根据 VIP 值分析筛选其DAMs。

图 4 黑老虎叶、茎和根中黄酮类代谢物分布及丰度Fig. 4 Distribution and accumulation of flavonoid metabolites in roots, stens and leaves of Kadsura coccinea

表 2 3组比较的OPLS-DA 模型验证值Table 2 OPLS-DA model validation values for three groups

基于OPLS-DA结果，根据DAMs筛选标准，KL vs KS筛选到的DAMs最少，为55个，KL vs KR和KS vs KR 分别筛选到67个和59个(图5)。3 组对比DAMs总数为74个，均为DAMs的有38个，其中33个呈连续下调趋势，仅有3个为连续上调；下调DAMs比例均在80%左右，其以黄酮醇占主导。这表明3个部位类黄酮的分离现象主要由黄酮醇类DAMs所造成。

图 5 不同对照组中差异代谢物数量Fig. 5 Number of differentially accumulated metabolites (DAMs) among the three pairwise groups

进一步选出差异倍数排在前20(上调和下调)的DAMs(图6)，3组对照中DAMs下调的倍数明显大于上调，下调物质以黄酮醇为主，其中山萘酚-3--半乳糖苷(三叶豆苷)的倍数最大，为20.05(下调)。

A. 叶与茎; B. 叶与根； C. 茎与根。A. KL vs KS; B. KL vs KR； C. KS vs KR.图 6 差异倍数最大的 20 种代谢物Fig. 6 Top 20 DAMs among the three pairwise groups

2.4 代谢通路分析

利用 KEGG 数据库对3组对照中的DAMs进行注释，并进行通路富集分析。以<0.01 为阈值筛选显著富集通路，获得 1条富集极显著的通路，即黄酮和黄酮醇的生物合成途径(flavone and flavonol biosynthesis)。3组对照共有12个DAMs注解到该通路中，分别是山奈酚、槲皮素、3,7-二--甲基槲皮素、丁香亭、山奈酚-3--半乳糖苷(三叶豆苷)、山奈酚-3--葡萄糖苷(紫云英苷)(黄芪苷)、木犀草素-7--葡萄糖苷 (木犀草苷)、槲皮素-3--葡萄糖苷(异槲皮苷)、木犀草素-7--新橘皮糖苷 (忍冬苷)、山奈酚-3--芸香糖苷(烟花苷)、槲皮素-3--桑布双糖苷、槲皮素-3--芸香糖苷 (芦丁)。通过代谢通路图可以看出，其中有10个DAMs在叶中丰度显著高于茎和根，仅有2个在根中向上表达(图7)，进一步表明黑老虎叶(茎)中富含黄酮和黄酮醇相关代谢物。

黑点处为非DAMs，红点处为DAMs，名称附近的热图代表该物质在3个部位中丰度 (离子流强度经log10转化)。Metabolites with black dot denote non-differentially accumulated metabolites, while those with red dot denote differentially accumulated metabolites detected in leaf (KL), stem (KS) and root (KR). The heatmap near each DAMs gives the level of abundance in each organ (The ion intensity of each metabolite is transformed by log10).图 7 黄酮和黄酮醇生物合成途径的代谢物Fig. 7 Metabolites involved in flavone and flavonol biosynthesis pathway

3 讨论与结论

本研究基于广泛代谢组学技术，在黑老虎叶、茎、根中鉴定出多种富集度高，具有重要生物活性和药理作用的黄酮类化合物，表明其具有显著利用价值。例如，3个部位中儿茶素及衍生物在文中表达量都较高，研究证实这类物质不仅具有抗炎症、抗菌、抗病毒及抗氧化等效用，而且可以预防心脑血管疾病(Nance et al., 2009; Tadashi et al., 2010)以及可以保护肾脏、肝脏和神经系统等(延玺等，2012)。此外，儿茶素还是茶叶中的主要功能成分。同时，叶中富含槲皮素及其衍生物，其具有优异的抗氧化特性(Pu et al., 2008)，在神经系统疾病、炎症、肝脏疾病、心血管疾病、细菌和真菌感染(Yao et al., 2008)、抗癌(Chou et al., 2010)等疾病中具有重要药理作用，对维持人体健康至关重要。

本研究中，黑老虎作为民间中药材之一，主要以根入药，而代谢组解析发现，叶和茎中类黄酮多样性和丰度都优于根，提示其可药用的可能。根中特有类黄酮成分3个，分别为2′-羟基-3,4,5,3′4′,6′-六甲氧基查耳酮、5,7,8,4′-四甲氧基黄酮、5-羟基-7,8,2′,6′-四甲氧基黄酮，研究表明多甲氧基黄酮的生物学活性明显优于非多甲氧基黄酮(Kurowska & Manthey, 2004; Whitman et al.,2005)，但是否为支持其传统药用方式的关键物质基础还有待进一步研究。本研究叶和茎中含有大量与根相同和多种根中没有的黄酮类成分，表明3个部位会具有相似的生物活性，可考虑替代或互补利用(尤其近10 a黑老虎药用资源明显减少，而其果实作为一种新型水果被广泛关注， 种植面积不断扩大，有大量被修剪的茎和叶)。筛选到的显著富集通路(黄酮和黄酮醇生物合成途径)，为进一步利用生物工程定向积累具有重要生物学功能的类黄酮提供参考。

本研究在黑老虎植株中共鉴定出黄酮类代谢物85个，其中以黄酮和黄酮醇占主导，黄酮醇类、黄酮类、黄烷醇类和查尔酮类富集度较高。叶、茎、根中类黄酮多样性和丰度存在显著差异，黄酮醇类分布不均衡是多样性差异的主要原因，而丰度主要受黄酮醇和黄酮积累模式(向下或向上)的影响。