武绍龙， 唐 明， 张习敏， 唐 婧*

( 1. 贵州师范大学 生命科学学院， 贵阳 550025； 2. 贵州师范大学， 贵州省植物生理与发育调控重点实验室， 贵阳 550025； 3. 贵州师范大学， 国家林业和草原局西南喀斯特山地生物多样性保护重点实验室， 贵阳 550025 )

马缨杜鹃()属于常绿灌木或小乔木，因其花色鲜艳，形状酷似马头饰的璎珞而得名，主要分布于西南地区，包括四川西南部、云南全省和贵州西北部等(张长芹等，2015)，其中贵州西北部以普底和金坡景区分布最为广泛，为主要的建群种和优势种(李苇洁和陈训，2005)。每年3月中旬前完成初花期(花瓣开始开张到10%花序开放)；3月下旬到4月初进入为盛开期(10%花序开放到10%花序出现凋谢)；4月中旬进入凋谢期(10%花序出现凋谢到70%花序出现凋谢)，马缨杜鹃整个花期为25～30 d。研究马缨杜鹃花开花至凋谢进程中的代谢组分变化，对延长和调节马缨杜鹃花期，充分发挥马缨杜鹃的观赏价值和经济价值，对贵州省地方经济以及乡村振兴具有极其重要的研究意义。目前，关于马缨杜鹃花主要包括花特征和花粉性状的研究，以百里杜鹃保护区马缨杜鹃为实验材料研究花特征分化和资源分布情况(胡德美 等，2021)；用显微镜观察马缨杜鹃花粉形态大小、外壁纹饰、孔沟形态等性状(毛加宁，2000)。同时，在马缨杜鹃花花期调控的研究则主要集中于营养元素、植物激素和温度等处理方法，包括用不同浓度的N、P、K、Ca等营养元素处理马缨杜鹃观察对花芽发育和花期的影响(洪鲲等，2010)；在马缨杜鹃花芽发育初期和开花前期喷施外源激素对始花期、盛开期、末花期和开花数的影响(宋庆发等，2010)；通过不同浓度的生长调节物质及矿物质营养处理马缨杜鹃的花蕾，探索马缨杜鹃花花期调控方法(岳保超，2015)。目前，仅有少量关于马缨杜鹃茎和根代谢物的研究报道，利用各种色谱技术从马缨杜鹃的茎分离鉴定得到10种化合物(徐金金等，2012)，然而马缨杜鹃花的发育进程中代谢物和代谢物途径研究尚未见相关报道。

近年来，植物代谢组学研究已经被广泛地应用于分析果树生长、发育、果实成熟过程中的代谢物变化(Aaron et al., 2008；Zhang et al., 2011；Li et al., 2020)，目前也开始应用于研究植物花形成、发育的代谢机制研究(贾岩等，2017；程少禹 等，2020)；薛水玉等(2012)采用气相色谱-质谱法技术分析款冬花不同发育阶段代谢组，发现款冬花蕾发育过程中部分特征代谢物呈现显著变化；He等(2020)利用转录组和代谢组研究铁皮石斛花的发育机制，发现次生代谢和碳水化合物的变化与花的发育有关；徐红霞等(2020)采用GC-MS技术检测枇杷花发育进程中的代谢物质，揭示影响花发育进程的生理与代谢机制。代谢组学对植物花的发育代谢产物及代谢通路研究提供了方法。

本研究以贵州省毕节市大方县百里杜鹃风景区为研究区域，以马缨杜鹃花为研究对象。选取花苞期、开裂期、传粉期、盛开期、衰老期和凋谢期的花为材料，采用非靶向代谢组学(LC-MS/MS)分析方法，研究马缨杜鹃花开花至凋谢进程中6个阶段的代谢产物及代谢通路，拟探讨以下问题：(1)马缨杜鹃花开花至凋谢进程中不同阶段代谢物如何变化；(2)分析马缨杜鹃花差异显著的代谢物和相关的代谢通路；(3)筛选出与马缨杜鹃花发育相关的重要代谢物。本研究结果为马缨杜鹃花花期调控提供理论基础和科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验材料为贵州省毕节市大方县百里杜鹃风景区马缨杜鹃。

2020年选取长势基本一致马缨杜鹃，分别在花苞期(3月20日)、开裂期(3月24日)、传粉期(3月30日)、盛开期(4月3日)、衰老期(4月10日)、凋谢期(4月15日)，从6株树上采集适量马缨杜鹃花样本，经液氮冷冻后运回实验室进行代谢组学检测，每个时期取6个生物学重复样本。

1.2 马缨杜鹃花代谢物提取

基于液质联用(LC-MS/MS)技术(Warwick et al., 2011；Want et al., 2010)进行非靶向代谢组学研究。取100 mg液氮研磨的马缨杜鹃花样本，置于EP管中，加入500 μL含0.1%甲酸的80%甲醇水溶液，涡旋震荡，冰浴静置5 min，15 000 r·min、4 ℃离心10 min，取100 μL的上清加超纯去离子水稀释至甲醇含量为53%，并置于离心管中15 000、4 ℃离心10 min，收集上清液，进样LC-MS/MS进行检测分析。

从每个实验样本中取等体积样本混匀作为(quality control)QC样本。空白样本为含0.1%甲酸的53%甲醇水溶液代替实验样本，前处理过程与实验样本相同。

1.3 非靶向代谢组学(LC-MS/MS)检测

采用Thermo Hyperil Gold column色谱柱(C18)，柱温40 ℃，流速0.2 mL·min。正离子模式：流动相A为0.1%甲酸，流动相B为甲醇；负离子模式：流动相A为5mmol醋酸铵(pH 9.0)，流动相B为甲醇；梯度洗脱(0 ～ 1.5 min，98%A，2%B；1.5 ～ 12 min，100%B；12 ～ 14 min，100%B；14 ～ 14.1 min，98%A，2%B；14.1 ～ 17.0 min，98%A，2%B)。进样量为10 μL。利用Thermo Vanquish UHPLC液相色谱Thermo QE系列质谱分别进行正、负离子模式采集。扫描范围选择70 ～ 1 050；ESI源的设置如下：Spray voltage为3.2 kV；Sheath gas flow rate为35 arb；Aux gas flow rate为10 arb；Capillary temp为320 ℃。Polarity：positive；negative；MS/MS二级扫描为data-dependent scans。每10个分析样本进行一次QC样本，评价整个实验过程中仪器状态的稳定性和检测数据结果的准确性。

1.4 数据分析

将采集到的原始数据导入CompoundDiscoverer 3.1(CD)软件中，通过保留时间、质荷比对数据进行过滤，然后根据保留时间偏差0.2 min和质量偏差5 μg·mL进行峰对齐，随后根据质量偏差5 μg·mL、信号强度偏差30%(Dai et al., 2017)等信息进行峰提取，同时对峰面积进行定量，再整合目标离子，然后通过分子离子峰和碎片离子进行分子式的预测并与mzCloud、mzVault和MassList数据库进行比对，用blank样本去除背景离子，并对定量结果进行归一化，最后得到数据的鉴定和定量结果。

使用MetaX(Wen et al., 2017)软件对数据进行对数转换处理，将所有实验样本和QC样本导入SIMCA14.1软件进行多元统计分析(阿基业，2010)，采用主成分分析(PCA)观察各样本的整个过程的稳定性，然后进一步使用有监督的正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)来区分各组间代谢物的差异性。根据多变量OPLS-DA模型分析中变量权重(>1)、结合检验的值(<0.05)和单变量分析差异倍数(fold-change，>2或<0.5)筛选差异代谢物。维恩图由TB tools 0.6软件完成，代谢通路富集分析基于KEGG数据库。

2 结果与分析

2.1 马缨杜鹃花开花至凋谢过程的形态变化

将马缨杜鹃花开花至凋谢过程分为6个时期，如图1所示。花苞期(A)：花未开，表现为花苞状态，内部花药还未成熟，雄蕊未开裂；开裂期(B)：花苞已经初步打开，雄蕊刚开裂，雌蕊柱头上未有花粉；传粉期(C)：花苞较为开发，雄蕊完全裂开，雌蕊柱头上已经结合覆盖花粉；盛开期(D)：花朵呈现完全盛开，颜色艳丽，雄蕊已经完全开裂，且花粉已经全部裂出，雌蕊柱头上花粉已经不多，传粉受精已完成；衰老期(E)：花朵开始凋谢，出现萎蔫状态；凋谢期(F)：花朵完全枯萎、凋谢和萎蔫。

A. 花苞期; B. 开裂期; C. 传粉期; D. 盛开期; E. 衰老期; F. 凋谢期。A. Bud stage; B. Dehiscence stage; C. Pollination stage; D. Blooming stage; E. Senescence stage; F. Withering stage.图 1 马缨杜鹃花开花至凋谢过程的形态变化Fig. 1 Morphological changes of Rhododendron delavayi from flowering to withering

2.2 马缨杜鹃花样本主成分分析

为分析马缨杜鹃花各个时期间代谢组的相互关系，采用主成分分析(PCA)通过建立数学模型进行正交变换简化降维分析样本间代谢谱的内部结构关系。马缨杜鹃花主成分分析(图2)表明，不同时期代谢物各组间存在明显的分离趋势，每个样本的数据处理结果可信，每个样本之间存在明显差异，且组内生物学重复重叠效果好，说明在实验过程中数据组的重现性好，可用于后续差异代谢物分析。花苞期和开裂期、传粉期、盛开期代谢物的变化相对较大，衰老期与凋谢期的代谢物相对最大。

A. 正离子模式; B. 负离子模式。 QC. 质控样本; B. 花苞期; PD. 开裂期; P. 传粉期; AP. 盛开期; S. 衰老期; F. 凋谢期。下同。A. Positive ion mode; B. Negative ion mode. QC. Quality control sample; B. Bud stage; PD. Dehiscence stage; P. Pollination stage; AP. Blooming stage; S. Senescence stage; F. Withering stage. The same below.图 2 马缨杜鹃花开花至凋谢进程中代谢物PCA模型得分图Fig. 2 PCA model scores of metabolites from flowering to withering of Rhododendron delavayi

为筛选出马缨杜鹃开花至凋谢进程中的差异代谢物，采用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)区分6个时期代谢物的总体差异，结果如图3所示。马缨杜鹃开花至凋谢进程中，花苞期、开裂期、传粉期、盛开期、衰老期、凋谢期6个时期的代谢物明显分离，表明各组样本代谢物存在显著性的差异变化。该模型质量参数和均大于0.9，说明当前OPLS-DA分析模型稳定可靠，具有良好的预测能力，有利于寻找潜在的马缨杜鹃开花至凋谢进程中的差异代谢物。

图 3 马缨杜鹃花开花至凋谢进程中代谢物OPLS-DA得分图Fig. 3 OPLS-DA scores of metabolites from flowering to withering of Rhododendron delavayi

2.3 马缨杜鹃花代谢物分析

研究马缨杜鹃花开花至凋谢进程中代谢物的变化，采用LC-MS/MS检测马缨杜鹃花6个时期的代谢物多峰图，花苞期代谢物色谱图见图4。共检测到973种代谢物，正离子模式587种，负离子模式386种，其中黄酮类114种；有机酸114种；酚酸类112种；氨基酸及其衍生物75种；脂类61种；生物碱57种；萜类45种；核苷酸及其衍生物43种；糖类及其衍生物36种；苯丙素类33种；醇和多元醇33种；鞣质11种；甾体3种；其他类236种。

图 4 LC-MS/MS代谢物检测多峰图Fig. 4 LC-MS/MS metabolite detection multimodal graph

2.4 差异代谢物分析

根据OPLS-DA模型的变量重要性投影值筛选马缨杜鹃花6个时期的差异代谢物(>1、<0.05和>2 或<0.5)。从花苞期、开裂期、传粉期、盛开期、衰老期到凋谢期进行相邻两个时期的代谢组比较，结果发现：马缨杜鹃花开花到凋谢进程中共有591种差异代谢物。其中，花苞期与开裂期有170种差异代谢物(正离子模式87，负离子模式83)，48种上调，122种下调；开裂期与传粉期有144种差异代谢物(正离子模式89，负离子模式55)，68种上调，76种下调；传粉期与盛开期有111种差异代谢物(正离子模式67，负离子模式44)，75种上调，36种下调；盛开期与衰老期有284种差异代谢物(正离子模式184，负离子模式100)，177种上调，107种下调；衰老期与凋谢期有314种差异代谢物(正离子模式180，负离子模式134)，260种上调，54种下调。在马缨杜鹃花期进入衰老期和凋谢期后差异代谢物数量明显增多于开花过程，且大部分是表达量显著上升的差异代谢物。而在马缨杜鹃花苞期至开裂期过程中，差异代谢物中大部分的表达量显著下调。差异代谢物维恩图分析表明(图5)，绝大部分(≥46.8%)的差异代谢物都只出现在一个相邻变化时期，没有任何差异代谢物出现在整个开发至凋谢过程。

A. 上调代谢物； B. 下调代谢物。A. Up-regulated metabolites； B. Down-regulated metabolites.图 5 马缨杜鹃花开花至凋谢进程中差异代谢物维恩图Fig. 5 Venn diagram of differential metabolites from flowering to withering of Rhododendron delavayi

2.5 代谢通路分析

通过KEGG Pathway富集分析显著差异代谢物(Kanehisa & Goto, 2000；Lin et al., 2014)，如图6所示。注释到68条代谢通路，显著代谢通路(<0.05)要有6条，分别是苯丙素类生物合成，植物激素的生物合成，类黄酮生物合成，精氨酸和脯氨酸代谢，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成鸟氨酸、赖氨酸和烟酸生物碱的生物合成。其中，极显著的代谢通路(<0.01)包括苯丙素类生物合成、植物激素的生物合成和类黄酮生物合成。

图 6 马缨杜鹃花开花至凋谢进程中差异代谢物主要代谢通路富集分析Fig. 6 Enrichment analysis of main metabolic pathways of differential metabolites from flowering to withering of Rhododendron delavayi

本研究根据代谢组学分析差异代谢物与代谢通路的关系，挖掘与马缨杜鹃花开花至凋谢相关的差异代谢物，推测代谢物可能的作用机制。结合代谢通路图(图7)，共筛选到10种差异代谢物，包括苯丙氨酸(L-phenylalanine)、反式肉桂酸(-cinnamic acid)、 查耳酮 (chalcone)、 柚皮素(naringenin)、对香豆酰基莽草酸(-coumaroyl shikimic acid)、阿魏酸(ferulic acid)、松柏醇(coniferyl alcohol)、芥子酸(sinapic acid)、紫丁香苷(syringin)、槲皮素(quercetin)。在马缨杜鹃花的6个时期，代谢物含量表达如图6所示，苯丙素类生物合成相关的差异代谢物包括苯丙氨酸、反式肉桂酸、对香豆酰莽草酸、松柏醇、芥子酸、紫丁香苷在衰老期(S)和凋谢期(F)两个时期均为上调表达，特别是在凋谢期(F)达到最高值；而黄酮类生物合成相关的代谢物柚皮素、槲皮素和查尔酮随着花的生长发育含量呈现下调表达。在‘夏黑’葡萄二季果冬芽分化关键时期，CCC处理会诱导苯丙素合成和类黄酮合成通路中部分基因的上调或下调表达，通过改变与成花相关的基因表达和次级代谢产物的合成和代谢来实现促进成花(时晓芳等，2021)。转录组学分析不同发育阶段款冬叶，发现叶片生长发育的过程中苯丙素类生物合成相关基因表达量不断增多(聂佳慧等，2018)。马缨杜鹃花开花至代谢进程中苯丙素类代谢物表达量逐渐升高，而黄酮类代谢物表达量逐渐降低，苯丙素类和黄酮类代谢物表达可能与马缨杜鹃花发育有关。

图 7 苯丙素类、黄酮类等有效成分生物合成通路Fig. 7 Biosynthesis pathway of active components about phenylpropanes and flavones

3 讨论与结论

3.1 马缨杜鹃花差异代谢物

代谢物是生物体表型的基础，能帮助我们更直观有效地了解生物学过程及其机理(熊欢欢等，2019；霍冬敖等，2021)。采用GC-MS技术对枇杷花整个发育进程中代谢物质分析，C/N含量比是决定花发育进程的重要因素之一(徐红霞等，2020)。长期以来马缨杜鹃花花期调控一直都是研究热点，马缨杜鹃花的开花至凋谢进程是十分复杂的生理过程，该过程可能与代谢物种类和含量密切相关。本研究采用非靶向代谢组学方法，研究马缨杜鹃花开花至凋谢的6个时期(花苞期、开裂期、传粉期、盛开期、衰老期和凋谢期)代谢物变化。通过代谢组学分析，共筛选获得591种差异表达代谢物，主要包括黄酮类、有机酸、酚酸类、氨基酸，及其衍生物、脂质和生物碱等，这些差异代谢物在花的生长发育不同时期表达情况不相同，随着马缨杜鹃花的生长发育差异代谢物在花苞期至盛开期逐渐减少，进入衰老期和凋谢期后显著增加；而上调代谢物在整个开花至凋谢进程中逐渐增加，并且在凋谢期达到最大值；下调代谢物则在花苞期至盛开期逐渐减少，衰老期增加，凋谢期减少。本研究表明，马缨杜鹃花的不同发育阶段差异代谢物种类和表达可能与花的开花至凋谢进程密切相关。

3.2 马缨杜鹃花差异代谢通路

基于KEGG PATHWAY数据库对差异代谢物富集分析，注释到68条代谢通路，其中3条极显著的代谢通路(< 0.01)分别是苯丙素类生物合成、植物激素的生物合成和类黄酮生物合成。其中，苯丙素类生物合成是最显著的代谢通路，苯丙氨酸为下游次生代谢产物提供原料。本研究基于苯丙素类、黄酮类等有效成分生物合成通路共筛选获得10种有效成分生物合成有关的差异代谢物。进一步研究发现，苯丙素类生物合成相关的代谢物表达量同马缨杜鹃花的其他时期相比，在衰老期和凋谢期代谢物表达量逐渐升高，而黄酮类生物合成相关的代谢物随着花的生长发育含量呈现下调表达，这些代谢物可能对马缨杜鹃花凋谢有重要调控作用。在马缨杜鹃花的花苞期苯丙氨酸表达量相对较低，随着花的生长发育代谢物表达量逐渐升高，代谢通路上相关代谢也发生相应变化，说明它对整个代谢通路的完成具有重要调控作用。

现有研究发现，苯丙素类生物合成是最重要的植物次生代谢途径之一(Dong & Lin, 2021)，植物的苯丙素类生物合成代谢途径及其分支途径会产生许多次生代谢产物，如色素、酚酸、黄酮、类黄酮、木质素等(文欢等，2017)。款冬花不同生长发育阶段的次生代谢物代谢组成明显不同，苯丙素类代谢物在发育初期至中后期表达量较高；黄酮类代谢物在发育的各个阶段表达量均有波动，但总体变化不大，次生代谢物累积促进花的发育(贾岩等，2017)。采用高通量测序技术对川佛手不同发育时期转录组学研究，发现苯丙素生物合成中7个相关基因随着果实的发育及变色呈现显著差异表达，提高其表达从而促进果实发育(潘媛等，2020)。苯丙素类生物合成途径的前端苯丙氨酸转化为反式肉桂酸，再由肉桂酸羟化酶(C4H)产生对羟基香豆酸，再经4-香豆酰-CoA 连接酶(4CL)催化生成4-香豆酸CoA，进一步向下游特异性合成途径，转化为不同的苯丙素类代谢产物，包括香豆素、黄酮类、萜类和木质素等(王玉等，2019；霍冬敖等，2021)。在马缨杜鹃花开花至凋谢进程中苯丙素类生物合成相关的差异代谢物苯丙氨酸、反式肉桂酸、对香豆酰莽草酸、松柏醇、芥子酸、紫丁香苷代谢物随着花的生长发育含量呈现上调表达，特别是在凋谢期(F)达到最高值；而黄酮类生物合成相关的代谢物柚皮素、槲皮素和查尔酮在花的生长发育过程中下调表达。对不同发育时期大白菜花的转录组研究，发现花香的主要成分是苯丙素，而黄酮类化合物是花、果实和种子的主要显色物质，此外它还能影响花瓣的伸长，促进花粉的萌发(李改珍等，2017)。在苯丙素类生物合成中L-苯丙氨酸(侯思宇等，2015)、柚皮素(Tu et al., 2016)、阿魏酸(Louie et al., 2010)等作为中间体，它们的表达量高低直接限制到下游代谢途径的进行，从而影响花的开花至凋谢过程。苯丙素类、黄酮类等代谢物作为重要次生代谢产物，推测其可能为马缨杜鹃花开花至凋谢进程具有重要的调控作用。更好地了解代谢物的生物合成与马缨杜鹃花开花至凋谢进程中的关系还需通过进一步的深入分子水平研究。

本研究通过非靶向代谢组学技术对马缨杜鹃花开花至凋谢进程中不同阶段的代谢成分进行分析，基于KEGG数据库对差异代谢物进行注释并获得了相应通路，构建了马缨杜鹃花中苯丙素类、黄酮类等有效成分生物合成途径，为进一步研究代谢物的基因调控作用以及全面解析代谢途径提供代参考，为延长马缨杜鹃花花期调控机制提供了理论基础和科学依据。