郑 旭 饶志勇 孟春颜 李 玥 张 薇 郭永鹏 吴 迪 王志祥*

(1.河南农业大学动物科技学院，郑州 450002；2.晨光生物科技集团股份有限公司，邯郸 057250)

现代集约化养殖方式极大地提高了畜牧业生产效率，但是也带来了很多动物健康问题。肉鸡因具有代谢旺盛、抗应激能力较差等特点，在高度规模化养殖条件下极易遭受外界环境及病原微生物的刺激，导致自由基过量产生，造成氧化损伤，使其生长性能及畜产品品质受到严重影响[1-2]。此外，畜禽饲粮中通常使用大量油脂来满足其较高的能量需求，但是油脂中的多不饱和脂肪酸极易氧化酸败，并同时引起饲粮中蛋白质和维生素的氧化损伤，导致养分溶解度和可消化性降低，饲粮品质和营养价值下降。不仅如此，畜禽采食氧化饲粮还会影响其消化吸收过程，降低机体免疫和抗氧化能力，影响健康生长[3-4]。因此，适量使用抗氧化添加剂来保障饲粮品质，提高畜禽抗氧化能力，使其生长潜能得到最大限度地发挥是提高畜牧业经济效益的关键[5]。

近年来，随着传统合成抗氧化剂效率低、毒副作用强等缺点不断显现[6]，研发安全高效无毒的天然抗氧化剂已成为饲料行业的热点问题[7]。研究表明，黄酮类化合物具备抗氧化、降血脂、抗肿瘤以及改善肠道菌群等[8-11]多种生物学功能，在食品、药物等领域均表现出了良好的作用效果[12]。畜禽饲粮中使用黄酮类饲料添加剂可以有效改善机体氧化还原状态[13]，在一定程度上缓解氧化损伤[14]，促进畜禽健康生长[15]。槲皮万寿菊素(quercetagetin)化学名称为3,3,4,5,6,7-六羟基黄酮(化学式为C15H10O8)，是提取自万寿菊的主要活性成分之一，属于黄酮类化合物中的黄酮醇类[16]。槲皮万寿菊素的体外抗氧化试验证实其具有较强的清除2,2-联苯基-1-苦基肼基(DPPH)、2,2′-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)和羟基自由基(·OH)的能力[17-18]，且关于其对肉鸡生长性能和免疫功能的影响已有部分报道，但其对肉鸡抗氧化能力及作用机制的研究还较少。因此，本试验旨在探究槲皮万寿菊素对肉鸡生长性能、养分表观消化率和抗氧化能力的影响，以期为天然抗氧化剂的研发和槲皮万寿菊素在肉鸡养殖中的合理应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物和试验材料

试验动物：爱拔益加(AA)肉鸡，购自河南田中禾农牧有限公司。

试验材料：槲皮万寿菊素，主要功能成分含量为81.88%，由河北某生物科技集团股份有限公司提供，以粉剂的形式拌料添加。

1.2 试验设计

试验选用480只健康1日龄AA肉鸡，随机分为4个组，每组6个重复，每个重复20只鸡。对照组饲喂玉米-豆粕型基础饲粮，试验组饲喂在基础饲粮中分别添加10、50和100 mg/kg槲皮万寿菊素的试验饲粮。试验期42 d，分为前期1～21日龄和后期22～42日龄。基础饲粮为参照AA肉鸡饲养标准配制的粉状配合饲料，其组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

1.3 饲养管理

试验前对鸡舍及器具进行消毒处理。饲养过程采用3层立体笼养，试验期间所有鸡只自由采食和饮水。鸡舍采用锅炉控温，自然光照加人工补光，相对湿度为50%～60%，自然通风结合纵向负压通风，定期打扫鸡舍，常规防疫和免疫。每天观察记录试验鸡采食、饮水及健康状况，及时记录试验鸡死淘情况及耗料量。

1.4 样品采集

在试验的第22天和第43天，从每个重复中选取1只接近平均体重的健康鸡，进行翅静脉采血，静置4 h，3 600 r/min离心10 min制备血清，-80 ℃冻存。其中，第43天采血后再进行颈静脉放血处死，解剖得到肝脏、胸肌样品，-80 ℃冻存，测定前使用匀浆机制备肝脏、胸肌匀浆液备用。

1.5 指标测定及方法

1.5.1 生长性能

试验第21天和第42天20：00开始禁食，自由饮水，分别在第1、22和43天对肉鸡以重复为单位称重，准确记录肉鸡体重及耗料量。

1.5.2 养分表观消化率

采用全收粪法，每个重复随机挑选2只接近平均体重的健康鸡，收集试验第38～41天全部排泄物称重，并准确记录期间采食量。收集粪样后加入10%硫酸溶液混匀，并在60～65 ℃烘干至恒重，自然状态下回潮24 h，称重记录，粉碎后过40目筛备用。饲粮和粪样中粗蛋白质含量采用凯氏定氮法测定，粗脂肪含量采用乙醚浸提法测定，钙含量采用乙二胺四乙酸二钠络合滴定法测定，磷含量采用钼黄比色法测定。

1.5.3 抗氧化能力

采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定血清、肝脏和胸肌总抗氧化能力(T-AOC)和超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性以及丙二醛(MDA)含量，测定时严格按照试剂盒说明书操作。

1.5.4 肝脏和胸肌核因子E2相关因子2(Nrf2)/抗氧化反应元件(ARE)信号通路相关基因表达

采用Trizol法提取肝脏和胸肌中的总RNA，按照TaKaRa Prime ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书制备cDNA，采用TaKaRa TB Green®Premix Ex TaqTMⅡ说明书进行实时荧光定量PCR测定。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计合成，选用三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参基因，根据2-ΔΔCt法对定量结果进行计算分析。引物序列见表2。

表2 引物序列

1.6 数据统计分析

试验数据采用SPSS 26.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Duncan氏法进行多重比较，同时对槲皮万寿菊素添加水平与效应进行回归分析。结果数据以“平均值±标准差”表示，以P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 饲粮中添加槲皮万寿菊素对肉鸡生长性能的影响

由表3可知，与对照组相比，50和100 mg/kg槲皮万寿菊素添加组肉鸡42日龄体重显著提高(P<0.05)。1～21日龄，与对照组相比，50和100 mg/kg槲皮万寿菊素添加组料重比(F/G)显著降低(P<0.05)。22～42日龄，与对照组相比，50和100 mg/kg槲皮万寿菊素添加组F/G显著降低(P<0.05)。1～42日龄，与对照组相比，50和100 mg/kg槲皮万寿菊素添加组肉鸡平均日增重(ADG)显著提高(P<0.05)，平均日采食量(ADFI)和F/G均显著降低(P<0.05)。各组肉鸡其他生长性能指标之间无显著差异(P>0.05)。

表3 饲粮中添加槲皮万寿菊素对肉鸡生长性能的影响

由表4可知，对生长性能相关指标进行二次曲线拟合，以42日龄体重、22～42日龄和1～42日龄ADG以及各阶段F/G为依据，肉鸡饲粮中槲皮万寿菊素的适宜添加水平为64.91～68.42 mg/kg。

表4 基于回归模型对肉鸡饲粮中槲皮万寿菊素适宜添加水平的估算

2.2 饲粮中添加槲皮万寿菊素对肉鸡养分表观消化率的影响

由表5可知，与对照组相比，50 mg/kg槲皮万寿菊素添加组肉鸡粗蛋白质表观消化率显著提高(P<0.05)，10 mg/kg槲皮万寿菊素添加组肉鸡粗脂肪表观消化率显著提高(P<0.05)。各组肉鸡钙、磷和粗灰分表观消化率之间均无显著性差异(P>0.05)。

表5 饲粮中添加槲皮万寿菊素对肉鸡养分表观消化率的影响

2.3 饲粮中添加槲皮万寿菊素对肉鸡抗氧化能力的影响

2.3.1 饲粮中添加槲皮万寿菊素对肉鸡血清抗氧化指标的影响

由表6可知，21日龄时，与对照组相比，50和100 mg/kg槲皮万寿菊素添加组肉鸡血清GSH-Px活性显著提高(P<0.05)；此外，饲粮中添加不同水平槲皮万寿菊素对肉鸡血清MDA含量、T-AOC以及SOD活性均无显著影响(P>0.05)。42日龄时，与对照组相比，10、50和100 mg/kg槲皮万寿菊素添加组肉鸡血清GSH-Px活性均显著提高(P<0.05)，各组肉鸡血清T-AOC、SOD活性和MDA含量之间均无显著性差异(P>0.05)。

表6 饲粮中添加槲皮万寿菊素对肉鸡血清抗氧化指标的影响

2.3.2 饲粮中添加槲皮万寿菊素对肉鸡组织抗氧化指标的影响

由表7可知，与对照组相比，10和50 mg/kg槲皮万寿菊素添加组肉鸡肝脏GSH-Px活性显著提高(P<0.05)；但各组肉鸡肝脏T-AOC、MDA含量和SOD活性之间均无显著性差异(P>0.05)。与对照组相比，10 mg/kg槲皮万寿菊素添加组肉鸡胸肌T-AOC和SOD活性显著提高(P<0.05)；但各组肉鸡胸肌MDA含量和GSH-Px活性之间均无显著性差异(P>0.05)。

表7 饲粮中添加槲皮万寿菊素对肉鸡组织抗氧化指标的影响

2.4 饲粮中添加槲皮万寿菊素对肉鸡Nrf2/ARE信号通路相关基因表达的影响

2.4.1 饲粮中添加槲皮万寿菊素对肉鸡肝脏Nrf2/ARE信号通路相关基因表达的影响

由图1可知，与对照组相比，50 mg/kg槲皮万寿菊素添加组肉鸡肝脏Nrf2的mRNA相对表达量显著提高(P<0.05)，10、50和100 mg/kg槲皮万寿菊素添加组肉鸡肝脏谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)的mRNA相对表达量均显著提高(P<0.05)；各组肉鸡肝脏超氧化物歧化酶1(SOD1)和谷氨酸半胱氨酸连接酶调节亚基(GCLm)的mRNA相对表达量之间无显著性差异(P>0.05)。

2.4.2 饲粮中添加槲皮万寿菊素对肉鸡胸肌Nrf2/ARE信号通路相关基因表达的影响

由图2可知，与对照组相比，10、50和100 mg/kg槲皮万寿菊素添加组肉鸡胸肌Nrf2和GPX1的mRNA相对表达量显著提高(P<0.05)，50 mg/kg槲皮万寿菊素添加组肉鸡胸肌GCLm的mRNA相对表达量显著提高(P<0.05)；各组肉鸡胸肌SOD1的mRNA相对表达量之间无显著性差异(P>0.05)。

3 讨 论

3.1 饲粮中添加槲皮万寿菊素对肉鸡生长性能的影响

研究表明，黄酮类化合物可以促进生长激素的生成和释放[19]，促进畜禽对养分的消化吸收[20]，在肉鸡饲粮中使用可以改善其生长性能[21]。Ouyang等[22]在饲粮中添加15 mg/kg苜蓿黄酮提高了AA肉鸡ADG。Goliomytis等[23]研究表明，饲粮添加0.5～1.0 g/kg槲皮素对肉鸡ADG和ADFI无显著影响，但是F/G与对照组相比有所下降。本试验结果发现，在基础饲粮中添加不同水平槲皮万寿菊素同样提高了肉鸡生长性能，其中饲粮添加50和100 mg/kg槲皮万寿菊素显著提高了肉鸡1～42日龄ADG，并显著降低了各阶段F/G；另外，本试验还发现，50和100 mg/kg槲皮万寿菊素添加组肉鸡1～42日龄ADFI较对照组显著下降，此现象在Yang等[24]、李丽平等[25]的试验中也存在，初步分析可能是黄酮类化合物气味酸涩，适口性较差，导致肉鸡采食量略有下降[26]。但是，由于黄酮类化合物的体外抗氧化功能可以有效减缓饲粮中油脂和蛋白质的氧化程度，提高饲粮质量，在一定程度上可以促进肉鸡采食后养分的吸收利用，所以最终反而促进了肉鸡生长[27]。

数据柱标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下图同。

3.2 饲粮中添加槲皮万寿菊素对肉鸡养分表观消化率的影响

黄酮类化合物具有良好的广谱抗菌性，可调控肠道微生物的分布[28]，通过促进有益菌群的繁殖抑制有害菌群的生长，进而改善消化道内环境，促进消化酶的分泌[29]，最终提高畜禽对饲粮中养分的吸收利用。王盛楠[30]研究表明，饲粮中添加0.02%槲皮素可显著提高AA肉鸡蛋白质表观消化率和胃蛋白酶活性，促进胸肌中蛋白质沉积。李垚等[31]研究发现，饲粮添加0.1%和0.2%沙棘黄酮显著提高了饲粮蛋白质利用率，从而提升肉鸡胴体品质，并显著改善肉品质。本试验结果发现，在肉鸡饲粮中添加10和50 mg/kg槲皮万寿菊素也分别显著提高了粗脂肪和粗蛋白质的表观消化率。其中，饲粮粗蛋白质表观消化率的提高一方面可以节省饲粮成本，缓解粮食资源紧缺问题；另一方面可以促进畜禽体内蛋白质的沉积，改善肉品质[32-33]。结合肉鸡生长情况分析发现，槲皮万寿菊素对饲粮中粗蛋白质和粗脂肪表观消化率的改善作用可能也是肉鸡生长性能有所提高的原因之一。

3.3 饲粮中添加槲皮万寿菊素对肉鸡抗氧化能力的影响

氧化还原状态在很大程度上可以反映机体的健康状况，畜禽体内通常存在多种抗氧化酶来调节氧化还原平衡[34-36]。多项研究表明，黄酮类化合物可通过激活抗氧化系统来提高抗氧化酶活性[37]，缓解氧化应激[38]，提高机体抗氧化能力。丘富安等[39]研究发现，车前子黄酮可以显著提高环磷酰胺诱导的氧化应激蛋鸡的血清T-AOC以及SOD、GSH-Px和过氧化氢酶(CAT)活性，并显著降低血清MDA含量。张毅峰[40]研究表明，饲粮中添加3.75 mg/kg槲皮万寿菊素显著提高了肉鸡42日龄血清SOD和GSH-Px活性以及T-AOC，显著降低了血清MDA含量。本试验结果发现，在肉鸡饲粮中添加10、50和100 mg/kg槲皮万寿菊素也不同程度提高了血清和肝脏GSH-Px活性，并提高了胸肌T-AOC和SOD活性，说明饲粮添加槲皮万寿菊素可以提高组织抗氧化酶活性，同时减少脂质过氧化产物生成，从而增强机体的抗氧化能力，为畜禽生长发育提供更加健康的环境。同时，肌肉抗氧化性能的提升也会缓解组织中蛋白质、核酸等大分子物质的氧化损伤，减少过氧化产物堆积对组织形态功能的破坏，使肉品质有所改善，货架期得到延长。

图2 饲粮中添加槲皮万寿菊素对肉鸡胸肌Nrf2/ARE信号通路相关基因表达的影响

Nrf2/ARE信号通路是至今为止发现的最为重要的抗氧化和防御信号通路，可调控下游二相解毒酶(GCLm)和抗氧化酶(SOD1、GPX1)基因表达，从而提高机体清除自由基的能力[41]，调节机体氧化还原平衡。Nrf2是调控动物体内抗氧化等保护机制的重要核转录因子，Nrf2核转位可激活Nrf2/ARE信号通路[42]。SOD1和GPX1是通路下游重要的抗氧化酶，直接参与机体氧化还原反应；GCLm对非酶抗氧化物谷胱甘肽(GSH)的合成起到重要作用。刘佳人等[43]研究表明，蒲公英黄酮能够显著上调小鼠血清和肝脏中抗氧化基因SOD1、超氧化物歧化酶2(SOD2)、GPX1和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的mRNA表达量。Ishfaq等[44]研究发现，饲粮添加450 mg/kg黄芩苷显著提高了肉鸡脾脏Nrf2的mRNA和蛋白表达水平，激活了Nrf2/ARE信号通路。本试验结果发现，在饲粮中添加10、50和100 mg/kg槲皮万寿菊素不同程度提高了肉鸡肝脏和胸肌中Nrf2、GPX1和GCLm的mRNA相对表达量，这与机体抗氧化酶活性升高的趋势是一致的，说明肉鸡饲粮中添加槲皮万寿菊素可以通过上调组织Nrf2/ARE信号通路相关抗氧化基因的表达水平，以提高抗氧化酶活性，从而增强机体抵御氧化应激的能力。此外，对机体氧化还原状态的调节作用可能也是槲皮万寿菊素发挥免疫调节、抗癌等其他功效的基础，所以本试验对槲皮万寿菊素抗氧化功能及机制的研究也为其后续在畜牧生产领域的研究和应用提供了理论依据。

4 结 论

① 综上所述，在肉鸡饲粮中添加适宜水平的槲皮万寿菊素能够改善其生长性能，提高饲粮中粗蛋白质和粗脂肪的表观消化率，还可以通过上调Nrf2/ARE信号通路相关基因表达的方式提高抗氧化酶活性，增强机体的抗氧化能力。

② 在本试验条件下，综合考虑ADG、F/G及经济效益等因素，槲皮万寿菊素在肉鸡饲粮中的适宜添加水平为64.91～68.42 mg/kg。