边伟帅 陈炜 甄洁 刘平 赵国敏 张辉

(首都医科大学附属北京世纪坛医院重症医学科，北京 100038)

健康人体中存在大量不同种类的微生物，参与人体发育、营养、免疫及疾病等各个方面。研究显示下呼吸道也存在大量的定植菌，正常状态下不会致病，而是维持着炎症反应及抗炎反应的动态平衡。呼吸道的菌群变化与呼吸系统疾病密切相关〔1〕，其中，肺炎是呼吸系统最常见的疾病之一，死亡率高达30.5%～46.6%〔2〕。对明确的病原菌进行精准的抗感染治疗有助于减低肺炎患者死亡率及减少耐药菌产生〔3〕。但肺炎患者多数为老年人，因老年人群免疫功能降低、炎症指标反应较差，临床表现常不典型，在病原学诊断上有一定困难〔4〕。而且鉴于目前对感染病原学的诊断，尤其针对细菌，主要仍基于细菌培养，而由于细菌的特性及培养条件，不能鉴定出所有致病菌，目前对于肺炎患者下呼吸道的菌群变化研究较少。本研究通过高通量二代测序基因技术对下呼吸道菌群多样性及存在的细菌进行鉴定，为临床治疗重症肺炎提供理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年1月至2020年1月入住首都医科大学附属北京世纪坛医院重症医学科的重症肺炎患者80例。纳入标准：临床肺感染评分>6分〔5〕；行经口气管插管及机械通气治疗；年龄>60岁；急诊入院患者。排除标准：存在慢性间质性肺病；肺结核；病毒性肺炎；免疫缺陷性疾病；部分肺切除；合并其他脏器感染。分组：A组：入院时即予以气管插管的社区获得性肺炎(CAP)患者35例；B组：入院48 h后予以气管插管的院内获得性肺炎(HAP)患者45例。记录患者年龄、性别、碳青霉烯类抗菌药物应用时间(CAR)、气管插管前住院时间(MV)、急性生理与慢性健康评估(APACHE)Ⅱ评分、C反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)、血清白蛋白(ALB)等指标。留取肺部痰液标本，利用高通量二代基因测序技术分析呼吸道微生物群落结构，比较A、B两组下呼吸道菌群变化。本研究已通过医院伦理委员会批准。

1.2标本采集 经气管插管应用一次性吸痰管将痰液负压抽取至灭菌集痰器中，然后转移至无菌EP管中，放置于-80℃冰箱保存。

1.3高通量二代基因测序 应用Ion S5 XL 平台进行扩增子测序分析。采用十六烷基三甲基溴化铵或 十二烷基磺酸钠方法对样本的基因组DNA进行提取，之后利用琼脂糖凝胶电泳检测 DNA的纯度和浓度，取适量的样品于离心管中，使用无菌水稀释样品至1 ng/μl。根据测序区域的选择，使用带Barcode的特异引物扩增得到相应产物，进行聚合酶链反应(PCR)扩增。PCR产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测。使用Thermofisher公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建库试剂盒进行文库的构建，使用Thermofisher的IonS5TMXL 进行上机测序。

1.4基因信息分析 基于得到的有效数据进行操作分类单元(OTUs)聚类和物种分类分析，并将OTU和物种注释结合，从而得到每个样品的 OTUs和分类谱系的基本分析结果。再对 OTUs进行丰度、多样性指数等分析，同时对物种注释在各个分类水平上进行群落结构的统计分析。最后在以上分析的基础上，可以进行一系列的基于OTUs、物种组成的聚类分析，应用主坐标分析(PCoA)，典型对应分析(CCA)等统计比较分析，挖掘样品之间的物种组成差异，并结合环境因素进行关联分析。

1.5统计学方法 应用Alpha多样性指数对物种多样性进行组间差异分析，通过t检验分析组间物种多样性平均值差异显著性。对多维数据中提取出的最主要的组间特征值和特征向量排序，使用R软件的WGCNA，stats和ggplot2软件包进行分析。对两组菌群丰度比较进行q检验。对组间的差异物种进行t检验。应用Spearman相关性分析方法对两变量的秩次大小进行线性相关分析。采用SPSS22.0软件进行t检验、秩和检验、χ2检验、q检验。

2 结 果

2.1两组一般资料比较 两组性别、年龄、ALB水平无明显差异(P>0.05)；A组APACHE Ⅱ评分、CRP、PCT水平明显高于B组(P<0.05)；B组MV时间、CAR时间明显高于A组(P<0.05)，见表1。

表1 两组一般资料比较〔M(P25,P75)〕

2.2门水平菌群丰度比较 在门水平，A组下呼吸道菌群丰度前5位依次为厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、拟杆菌门、软壁菌门；B组呼吸道菌群丰度前5位依次为变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、蓝藻菌门。A组下呼吸道菌群多样性(2 148.27±876.25)显著高于B组下呼吸道(1 247.79±759.77，P<0.05)；两组拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门存在明显差异(P<0.05)。见表2。

2.3属水平菌群丰度比较 在属水平，A组下呼吸道菌群丰度前5位依次是链球菌属、棒状杆菌属、不动杆菌属、支原体属、乳杆菌属，分别占下呼吸道总细菌数的20.49%、8.11%、5.78%、3.32%、3.19%；B组下呼吸道菌群丰度前5位依次是不动杆菌属、窄食单胞菌属、假单胞菌属、链球菌属、棒状杆菌属，分别占下呼吸道总细菌数的39.68%、31.62%、5.93%、4.85%、0.87%。两组不动杆菌属、窄食单胞菌属、链球菌属、棒状杆菌属等存在明显差异(P<0.05)。见表3。

2.4种水平菌群丰度比较 两组痰液标本进一步进行高通量宏基因组测序检测病原体，对大于104copies/ml的细菌进行分析，结果显示：A组肺炎链球菌、类白喉杆菌、乳杆菌、松卟啉单胞菌、牙周梭杆菌、产黑素普雷沃菌占比明显高于B组(P<0.05)；B组中鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌占比明显高于A组(P<0.05)。见表4。

表2 门分类水平两组菌群丰度比较

表3 属分类水平两组菌群丰度比较

表4 种分类水平两组菌群丰度比较〔n(%)〕

3 讨 论

本研究结果发现CAP病原学较HAP呈现更广泛的多样性。张鑫等〔6〕研究发现在肺部肿瘤肺部标本中以拟杆菌门、弧菌属为主，正常肺组织中以变形菌门、芽孢杆菌属为主。Hosgood等〔7〕通过454焦磷酸测序后分析，对健康中国女性痰液样本进行分析发现：厚壁菌门、链球菌属占优势。与本研究CAP菌群一致。孔忆秋等〔8〕研究显示在急性呼吸窘迫综合征患者呼吸道菌群中以厚壁菌门为主，而经过机械通气后厚壁菌门逐渐下降，变形菌门迅速上升，同时呼吸道菌群多样性下降。本研究显示随住院时间延长，尤其出现HAP后菌群多样性下降，与国外研究〔9〕类似。原因考虑为：应用广谱抗菌药物对正常气道菌群有杀伤作用，而耐药的定植菌进一步繁殖，而导致多样性的减少。

对物种而言，CAP中主要以肺炎链球菌、类白喉杆菌、乳杆菌、松卟啉单胞菌、牙周梭杆菌、产黑素普雷沃菌为主，多为口腔定植菌，一般不致病。但当人体抵抗力下降时,可引起感染，尤其是肺炎链球菌〔10〕。研究显示肺炎链球菌是引起肺炎、菌血症、脑膜炎、鼻窦炎和中耳炎的常见致病菌。成人重症社区获得性肺炎中肺炎链球菌处于首位〔11～14〕。部分地区感染率可达30%以上〔15〕。但在临床上，检测出肺炎链球菌的概率较低，考虑可能肺炎链球菌要求有较为严格的培养条件，常规的细菌培养方法在一定程度上难以发现致病菌，而且使用抗菌药物会明显降低肺炎链球菌的检出率〔16，17〕。本研究显示在重症CAP老年患者中链球菌比例明显增高，考虑致病菌为肺炎链球菌可能性大。应用高通量测序技术能尽早发现肺炎链球菌，为临床治疗提供依据。但曹桂花等〔18〕认为老年患者CAP以铜绿假单胞菌为主，考虑与其入选的患者为大于80岁的高龄老人有关。

根据中国医院获得性肺炎指南显示：HAP病原菌以鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌等为主〔19〕。宋骏等〔20〕研究认为由于抗菌药物的广泛使用,尤其在免疫力低下的患者中，鲍曼不动杆菌成为致病菌的可能性显著增加。张宁等〔21〕对308 例鲍曼不动杆菌肺部感染患者的研究显示：住院史及抗菌药物使用史均为鲍曼不动杆菌感染的独立危险因素。

嗜麦芽窄食单胞菌是广泛存在于自然界的一种非发酵革兰阴性菌。中国细菌耐药监测网〔22〕显示我国SMA分离率在非发酵菌中仅次于铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌。SMA现已成为医院感染的主要条件致病菌之一，抵抗力低下及基础病较重的患者为其易感人群，呼吸道为其易感部位，此外，SMA对碳青霉烯类等广谱抗菌药物天然耐药，容易获得外源性耐药基因而致多重耐药，故临床治疗较为困难，严重影响患者预后〔23〕。王芳等〔24〕研究显示嗜麦芽窄食单胞菌感染与住院时间及使用碳青霉烯类抗菌药物呈正相关，与本研究一致。应用高通量测序技术尽早发现嗜麦芽窄食单胞菌并予以合理抗菌药物治疗，可以有效减少SMA大量增殖。

综上，在重症肺部感染老年患者治疗过程中，了解下呼吸道菌群变化，尽早明确病原学，尽早开展针对性治疗，予以抢先治疗，是治疗成功的关键。但下呼吸道菌群受不同因素影响，各地区的病原谱存在差异，并且随着时间的推移而不断变迁，应根据本地的病原学特点进行精准治疗。