赵 雅 马 严 姚牧笛 蒋 沁 曹国凡

视网膜神经退行性疾病是视网膜各级神经元变性死亡、功能减弱或丧失的一类疾病，是世界范围内致盲的首要原因。包括糖尿病视网膜病变(DR)、青光眼、视网膜色素变性(RP)以及年龄相关性黄斑变性(AMD)等。其共同的特点和病理学过程是神经元的进行性退变和神经胶质细胞的过度活化[1]。由于神经元的不可再生性，目前可用的治疗方法只能延缓发病或减缓视力损害的进展，暂无有效的治愈方法。因此，进一步挖掘疾病的发生发展机制，寻找相关诊断标记物和治疗靶标可能为该类疾病的早期防治提供新方向。近年

来，多项研究表明[2-3]，表观遗传修饰可在不影响DNA序列的前提下，通过DNA甲基化、RNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA调控等形式调节视网膜神经退行性疾病相关基因表达。干预基因组的表观遗传谱在疾病的治疗上表现出良好的前景。本文就表观遗传修饰在视网膜神经退行性疾病中的调控作用，视网膜神经退行性疾病表观遗传疗法进行综述，以期为该类疾病的分子机制探索及靶向药物研制提供一定的理论基础。

1 表观遗传学与视网膜神经退行性疾病

1.1 DNA甲基化与视网膜神经退行性疾病DNA甲基化由DNA甲基转移酶(Dnmt)催化，多发生在CpG胞嘧啶C5位，形成5-甲基胞嘧啶进而抑制基因表达[4]。视网膜组织中，Dnmt表达在不同细胞及不同发育阶段具有差异性。Dnmt3和Dnmt1参与视网膜神经元的发生和稳态维持，分别在视网膜神经元早期以及终末分化中起重要作用[5]。另外，DNA甲基化作为一种可逆修饰，可以在细胞增殖中被动丢失或被10-11易位蛋白(TET)酶主动去除。有研究报道，TET3、5-羟甲基胞嘧啶等DNA去甲基化关键酶及产物在小鼠视网膜分化过程中表达增加[6]。在斑马鱼视网膜中，TET2和TET3可能通过调节Notch和Wnt信号通路作用于视网膜神经元的分化过程[7]。这些研究提示，DNA甲基化或可通过调节视网膜神经元特异性基因的表达影响疾病发生发展。

糖尿病视网膜神经变性是在高血糖环境中由于氧化应激、代谢紊乱、神经营养因子失衡和免疫损伤等多种因素造成的视网膜神经血管单元正常功能受损[8]。DR早期在视网膜微血管病变之前就出现视路神经元结构和功能的异常改变。而DNA甲基化可能与调节关键基因的表达和诱导糖尿病性周围神经病变有关。Duraisamy等[9]研究发现，Ras 相关的C3 肉毒素底物1和基质金属蛋白酶-9启动子区域甲基化的改变可引起线粒体功能障碍和氧化应激激活，促进DR发生发展。Kowluru等[10]观察到链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠视网膜表现出线粒体融合蛋白2和错配修复蛋白MutL同系物1启动子高甲基化，导致线粒体DNA错配增加和线粒体稳态受损，而Dnmt抑制剂可逆转上述现象。干预DNA甲基化或可通过维持线粒体稳态和氧化还原平衡来预防或逆转DR神经变性。然而，目前针对DR患者甲基化水平评估的研究却表现出显著差异，Maghbooli等[11]认为，DR患者血液中DNA甲基化水平明显升高。Agardh等[12]则发现，与对照组相比，增殖性DR患者血液中总体 DNA甲基化没有显著变化。因此，还需更多基础及临床研究以实现DNA甲基化在DR诊疗中的应用。

青光眼是以视网膜神经节细胞(RGC)及视神经轴突丢失为特征的变性疾病，房水循环障碍导致的高眼压是其主要危险因素。有研究发现，青光眼患者小梁网中DNA甲基化水平明显升高，伴有转化生长因子-β1启动子区域甲基化水平下降，导致细胞外基质过度积累、纤维化增强，进而引起房水流出受阻[13]。另外，Wan等[14]研究表明，小梁网中TET介导的生长分化因子7(GDF7)低甲基化同样是房水循环障碍的重要原因，GDF7过表达激活2型骨形成蛋白受体/Smad信号通路，上调α-平滑肌肌动蛋白、纤连蛋白和胶原蛋白的表达，引起小梁网纤维化，而GDF7的中和抗体可抑制上述病理过程。

RP 主要表现为进展性的夜视能力下降、周边及中心视力丧失和色觉受损，光感受器细胞损伤是其病理学标志。Farinelli等[15]在RP模型鼠rd1、rd2、P23H和S334te中检测到变性的光感受器中胞嘧啶甲基化增加。通过对光感受器细胞核形态的超微结构分析显示，视网膜变性期间染色质结构发生严重改变，这与rd1小鼠模型中Dnmt3a的表达增加相吻合，表明Dnmt的抑制可能减少光感受器细胞的丢失。Wahlin等[16]报道rd1小鼠光感受器的高甲基化主要与Caspase-3依赖的细胞凋亡有关。这些研究表明DNA甲基化与光感受器细胞丢失之间存在复杂的关系，这可能是视网膜变性疾病的一种机制，也是其治疗的新靶点。

1.2 RNA甲基化与视网膜神经退行性疾病与DNA甲基化类似，RNA上多种可逆甲基化修饰作为表观遗传修饰新层面受到广泛关注。N6-甲基腺苷(m6A)是RNA最丰富的甲基化修饰形式，受三类相关酶调节，甲基转移酶(Writers)[甲基转移酶样3(METTL3)、甲基转移酶样14(METTL14)和Wilms肿瘤-1相关蛋白(WTAP)等]、去甲基化酶(Erasers)[脂肪和肥胖相关蛋白(FTO)和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶同系物5(ALKBH5)]、m6A识别蛋白(Readers)[RNA结合蛋白(YTHDF)1-3、YTH结构域的蛋白(YTHDC)1/2等][17]。其主要通过影响RNA结构及RNA之间相互作用，广泛参与RNA稳定性、翻译、剪接和定位等调控过程。在肥胖、癌症、糖尿病、不育和发育停滞等人类疾病中发挥重要作用。

多项研究证实，METTL3、METTL14、FTO和YTHDF2等m6A修饰关键酶参与调控脑神经元发育、神经元的损伤修复以及神经干细胞的自我更新和分化，可能促进神经系统疾病的干细胞治疗[18-19]。但目前m6A修饰在视网膜神经退行性疾病中的研究仍处在起步阶段，已有研究报道尚少。仅有研究提示，METTL3/METTL14甲基转移酶复合体在视网膜发育之初就已经存在，随着视网膜的成熟，逐渐局限于内核层和神经节细胞层[20]。最近，Qu等[21]首次利用甲基化RNA免疫共沉淀结合高通量测序技术对视神经夹伤大鼠视网膜中m6A图谱进行研究，结果发现，与对照组相比，视神经夹伤大鼠视网膜中有2810个m6A甲基化修饰信号峰上调，689个信号峰下调。GO/KEGG富集分析表明，差异性m6A修饰的转录本主要与神经系统发育相关，且主要富集于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、核因子-κB(NF-κB)通路，表明m6A修饰可能在视神经夹伤后的病理生理过程中发挥重要作用，干预m6A修饰或可为视网膜神经退行性病变的治疗提供新策略。

1.3 组蛋白修饰与视网膜神经退行性疾病组蛋白修饰是指组蛋白N末端在多种酶的作用下发生乙酰化、甲基化、磷酸化等修饰的过程。其中以组蛋白乙酰化修饰研究最为广泛。组蛋白乙酰化由组蛋白乙酰转移酶和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)之间的平衡调节。组蛋白乙酰转移酶负责催化赖氨酸乙酰化，激活基因表达。HDAC则去除乙酰基抑制基因表达。HDAC根据其结构差异主要分为4类：I类包括HDAC1-3、8；II类包括HDAC4-7、9、10；III类是NAD+依赖的去乙酰化酶，包括沉默信息调节蛋白(SIRT)1-7；IV类主要是HDAC11[22]。虽然许多研究已证明，组蛋白去乙酰化与神经发育障碍、神经变性和衰老的认知障碍有因果关系[23]，但是不同HDAC亚型在疾病中的特异性调节作用尚未完全明确。

在DR的研究中，基于质谱分析发现，高血糖会诱导视网膜中组蛋白过度乙酰化，引起Müller细胞中细胞间黏附分子-1、诱导型一氧化氮合成酶等炎症因子表达增加。SIRT6在糖尿病小鼠视网膜内表达降低介导H3K9和H3K56高乙酰化，导致脑源性神经营养因子水平下降，视网膜全层变薄[24]。这些研究提示，组蛋白异常乙酰化可能与DR神经变性相关。此外，Wang等[25]研究表明，组蛋白H1变体HIST1H1C在糖尿病小鼠视网膜中表达上调，且主要定位于内核层和神经节细胞层。进一步研究发现，其可通过上调SIRT1和HDAC1以维持H4K16脱乙酰化状态，促进神经元异常自噬，进而引发视网膜炎症、神经元丢失和神经胶质细胞增生等DR早期病理变化，为DR神经变性机制提供新见解。

组蛋白异常乙酰化也参与青光眼RGC进行性丢失过程，但不同HDAC亚型在同一青光眼模型以及同一HDAC在不同青光眼模型中的作用不尽相同。在急性视神经损伤小鼠视网膜中SIRT1表达呈时间依赖性降低，白藜芦醇可激活SIRT1通路促进RGC存活[26]，表明SIRT1可能在RGC的损伤恢复中发挥重要作用；与之相反，HDAC2、3被检测到在急性视神经损伤小鼠RGC内表达增加，可引发组蛋白广泛去乙酰化、RGC标志基因沉默和核固缩等凋亡早期事件[27]，HDAC抑制剂的使用可逆转上述病理过程，延缓损伤进展[28]。然而，与急性视神经损伤小鼠模型中的研究相反，Schmitt等[29]对自发性青光眼小鼠模型的研究发现，条件性敲除HDAC3不能防止RGC丢失和轴突变性，HDAC抑制剂RGFP966对RGC的保护作用也有限。这种看似矛盾的结果可能与两种模型轴突损伤机制不同或者HDAC3对细胞凋亡调节的时间特异性有关。因此，不同HDAC亚型介导的不同位点乙酰化水平变化在疾病中的具体调控机制仍需我们进一步探索。

1.4 非编码RNA与视网膜神经退行性疾病非编码RNA(ncRNA)主要包括microRNA(miRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)和环状RNA(circRNA)。近年来，许多研究发现，ncRNA在转录的各个水平调节基因表达，参与机体生理病理过程。miRNA常结合于mRNA的3’非翻译区特定位点，阻止mRNA的翻译或促进mRNA的降解从而下调基因表达。lncRNA常通过与染色质修饰蛋白结合来改变其他表观遗传修饰状态，还通过与转录因子结合调控基因转录，或直接参与mRNA转录后调控，进而调节基因表达。circRNA则主要作为竞争内源性RNA，阻止miRNA与mRNA的作用，间接调节基因表达[30]。

1.4.1 miRNAmiRNA是研究最为广泛的ncRNA，在视网膜神经元生长、发育和损伤修复中起关键作用。近年研究发现，视网膜神经病变动物模型中存在多种失调miRNA，可通过调控氧化应激、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)、MAPK等信号通路调节神经元功能，参与疾病的发生发展[31-42](表1)。同时，在患者体液(血清、血浆、玻璃体液或眼泪)中发现的差异表达miRNA，或可通过与其他诊断标志物和成像技术结合，从而提高疾病的诊断能力，如DR患者中差异表达的miR-146a、miR-21和miR-34a/c等，青光眼患者中miR-204、miR-21和miR-149等[43]。虽然目前已发现许多疾病相关的miRNA，但由于实验所需的样本量大、miRNA调控靶标以及miRNA之间相互作用的复杂性，miRNA的研究主要局限于表达模式和调控表型变化的分析，实验验证的miRNA靶标有限，未来在miRNA的研究中应考虑更多可能的机制，构建更加完善的miRNA调控网络，并采用严谨的实验设计和多样化的实验方法，挖掘miRNA参与疾病的具体机制，从而更好地确定疾病早期诊疗新靶点。

表1 非编码RNA在视网膜神经退行性疾病中的作用

1.4.2 lncRNAlncRNA异常表达在视网膜神经退行性疾病中也发挥一定作用。Yan等[44]对链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠视网膜微阵列分析结果显示，在DR早期有303个异常表达的lncRNA。KEGG分析显示，这些lncRNA共表达的mRNA富集于轴突导向通路，提示lncRNA在DR早期神经退行性病变中起调节作用。随后诸多研究证实，SOX2重叠转录本(SOX2OT)、视网膜非编码RNA3(RNCR3)等可介导DR神经变性[45-46]，而核旁细胞转录本1(NEAT1)、转移相关肺腺癌转录本1(MALAT1)对高糖引起的视网膜神经病变起保护作用[47-48](表1)。其中，MALAT1的表达在视神经横断小鼠视网膜中也明显增加，其敲低会导致严重的视网膜神经病变。进一步研究发现，MALAT1通过活化环腺苷酸反应元件结合蛋白信号(CREB)通路促进Müller细胞和RGC存活，可能为视网膜神经退行性病变的治疗提供新靶标。多项研究发现，细胞周期激酶抑制因子4基因座中反义非编码RNA与原发性开角型青光眼有关，但确切的关联机制尚未完全明确，Wiggs等[49]认为，其可能通过调节邻近细胞周期依赖性激酶抑制基因2A/2B表达介导青光眼视神经退行性病变。近来有研究表明[50]，MALAT1和细胞周期激酶抑制因子4基因座中反义非编码RNA在青光眼患者血清中表达降低，且降低程度与疾病分期有关，两者的联合检测或可为青光眼诊断提供新靶标。

1.4.3 circRNAcircRNA因其丰富性、稳定性和物种间高度保守等特性而被广泛研究，其在青光眼中的作用也逐步得以揭示。有研究发现cZNF609和cZRANB1在青光眼小鼠视网膜中表达上调[51-52]，其敲低可减缓青光眼视神经变性的进展，而其过表达则增强Müller细胞活化，促进RGC凋亡。进一步研究发现，cZNF609和cZRANB1通过cZNF609/miR-615/METRN以及cZRANB1/miR-217/Runx2信号转导调节Müller细胞功能，间接调节RGC(表1)。Chen等[52]通过巩膜静脉结扎和微珠注射建立了两种慢性高眼压模型，共检测15 819个circRNA，全面表征了青光眼相关的circRNA表达谱。

2 表观遗传疗法

2.1 Dnmt抑制剂DNA甲基化的可逆性及可控性使其有望成为视网膜神经退行性疾病的治疗靶点。Dnmt抑制剂5-阿扎胞苷可改变线粒体DNA的甲基化状态，恢复线粒体融合蛋白2和错配修复蛋白MutL同系物1的线粒体积累，进而改善视网膜功能障碍[54]。另外，Lu等[55]发现八聚体结合转录因子4、性别决定区Y框蛋白2和Krüppel样因子4的过表达可使RGC中DNA甲基化重编程，促进青光眼模型和老年小鼠的轴突再生和视力恢复，为神经变性的治疗提供新思路。

2.2 HDAC抑制剂HDAC抑制剂具有视网膜神经元保护作用，并可促进Müller细胞的神经元再生，具有临床应用前景。一些临床前研究发现，白藜芦醇作用于氧化应激、脂质代谢、细胞凋亡及炎症反应等过程，发挥视网膜神经元保护作用[56]。曲古抑菌素A可有效防止缺血再灌注后视网膜变薄，减弱视网膜电图中a、b波振幅的变化。并可通过诱导小鼠组蛋白H3K27乙酰化，促进视网膜损伤后Müller细胞的神经元再生[57]。丙戊酸钠治疗则通过减少内质网应激介导的细胞凋亡通路中关键因子C/EBP同源蛋白表达以及Caspase-3、12的激活，减少RGC丢失，也可通过上调热休克蛋70的表达，减弱N-甲基-N-亚硝基脲诱导的小鼠光感受器细胞死亡[58]。但广谱HDAC抑制剂由于缺乏对异常表观遗传修饰基因的选择性，可能引起多系统的不良反应。进一步改善药物结构和给药方式有望突破这一难题。

2.3 非编码RNA药物视网膜神经退行性疾病中差异表达的ncRNA通过调控细胞凋亡、自噬以及炎症反应等过程推动疾病的发生发展，提示 ncRNA的干预可能控制疾病进程。现有的ncRNA药物主要分为4类：抑制致病RNA活性的反义RNA、siRNA和miRNA；调控蛋白质活性的RNA适配体；具有催化活性的核酶；基因编辑工具CRISPR的引导RNA。目前多种用于视网膜神经退行性疾病的ncRNA药物正处在临床前开发阶段，部分药物进入临床试验，如siRNA QPI-1007可通过抑制Caspase-2的激活发挥RGC保护作用，在非动脉炎性前缺血性视神经病变中完成II期临床试验。ARC1905作为RNA适配体选择性抑制补体C5，已在干性AMD中完成I期临床研究[59]。随着基因编辑技术的成熟及核酸药物递送技术的进步，ncRNA药物在疾病治疗方面表现出极大的潜力。

3 展望

随着第二代测序技术的应用，视网膜神经退行性疾病的表观遗传谱逐步得以揭示。越来越多的研究表明，表观遗传修饰可通过调节疾病相关基因的特异性表达，参与疾病的发生发展。表观遗传改变可协助疾病的精准诊断。大量临床前的研究也显示表观遗传疗法有望成为疾病的潜在治疗靶标。然而，由于表观遗传修饰的高度动态性及不同表观遗传修饰之间联系的复杂性，使得其在视网膜神经退行性疾病中的作用研究仍处在起步阶段。疾病不同阶段的特征性表观遗传修饰机制是什么？不同细胞的表观遗传修饰存在什么样的区别？表观遗传疗法如何应用于临床等问题还需解决。未来，单细胞表观基因组分析将有助于揭示细胞特异性的表观遗传谱，对表观遗传修饰相关酶进行细胞特异性敲除可以明确表观遗传修饰的确切作用，同时，多组学技术及算法模型的不断优化可能通过整合不同表观遗传修饰，从而确定它们在单个细胞或整个视网膜中的作用，构建全面的表观遗传调控网络，明确表观遗传修饰与疾病的因果关系，为疾病的诊疗确定最佳靶点。