夏文秀，吴方丽，侯 颖，张广维，党瑞杰，李 琳

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease， NAFLD)是一种以肝脏脂肪代谢紊乱及脂肪过度沉积为主要特征的代谢应激性肝损伤，是代谢综合征在肝脏的主要表现。全世界NAFLD患病率高达25%。脂肪变性是NAFLD的初始阶段，与胰岛素抵抗和血脂异常显著相关，亦有可能发展为不可逆性肝硬化和肝癌。采用药物缓解肝脏脂肪变性并探讨相关分子机制对于防治NAFLD具有非常重要的临床意义。大麻二酚(cannabidiol，CBD)是大麻素类天然化合物，其完全不具有精神活性。大麻素能调节脂质和葡萄糖的代谢，CBD能缓解肝纤维化和肝脏炎症，还能减轻酒精诱导脂肪肝病中的肝脏损伤。但CBD对NAFLD是否具有保护作用及其作用机制仍不清楚。老龄鼠更容易发生胰岛素抵抗。因此，本研究以老龄小鼠为模型，探讨CBD对高脂饮食老龄小鼠肝脏脂肪变性的保护作用及其分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂与仪器 15月龄雄性C57BL/6J小鼠(维通利华，北京)；CBD (CATO， 美国)；抗腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)抗体(#5832；CST，美国)、磷酸化(p)-AMPK抗体(#2535；CST， 美国)；乙酰辅酶A羧化酶(ACC)抗体(Ab45174；Abcam，英国)、p-ACC抗体(Ab68191；Abcam，英国)；β-actin抗体(BM0627；博士德，中国)；BCA蛋白定量试剂盒(博士德，中国)；qRT-PCR试剂盒(Takara，日本)；蛋白电转、电泳设备(Bio-Rad， 美国)；实时荧光定量PCR仪(FTC-3000P，Funglyn Biotech，加拿大)；便携式血糖仪及试纸(One Touch，美国)；自动生化分析仪(日立，日本)；酶联免疫吸附试验试剂盒(R&D Systems， 美国)；比色分析试剂盒(南京建成，中国)；显微镜(奥林巴斯， 日本)。

1.2 动物模型建立及分组 30只15月龄雄性C57BL/6J小鼠在中部战区总医院实验动物科适应性饲养2周后，随机分为三组：正常饮食组(NC组；普通饲料；=10)、高脂饮食组(HFD组；60%高脂饲料；=10)和CBD治疗组[CBD组；60%高脂饲料，腹腔注射CBD(10 mg/kg， 每周3次)；=10]。12周后，所有小鼠禁食过夜并实施安乐死后采集样本。

1.3 血清中相关指标测定 生化分析仪测定血清中葡萄糖、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)。酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒测定血清中胰岛素水平。比色分析试剂盒测定游离脂肪酸(FFA)。

1.4 组织学检测 小鼠肝脏组织标本于4%多聚甲醛中固定。使用冷冻切片机将组织切成5 μm厚的切片，油红O染色，在显微镜下观察肝脏的组织学变化。

1.5 葡萄糖耐量实验(IPGTT)和胰岛素耐量实验(ITT) 葡萄糖耐量实验前，三组小鼠禁食15 h，腹腔注射葡萄糖(2 g/kg)。胰岛素耐量实验前，将三组小鼠禁食5 h，腹腔注射胰岛素(0.75 U/kg)。分别在葡萄糖及胰岛素注射后15、30、 60 、90、120 min，尾静脉采血法及便携式血糖仪测定小鼠的血糖浓度，绘制IPGTT及ITT曲线并计算曲线下面积(AUC)。

1.6 相关基因mRNA检测 取小鼠肝脏组织，液氮速冻后研磨并使用TRIzol试剂提取总RNA，测定RNA浓度后定量1 μg RNA为模板，反转录为cDNA，使用实时荧光定量PCR仪检测脂肪酸合成酶(FAS)、固醇调节元件结合蛋白1c(SREBP1c)、ApoE、过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)和肉碱棕榈碱转移酶1a(CPT1a)的mRNA表达；PCR反应条件：95 ℃ 3 min；40个循环： 95 ℃持续 15 s， 60 ℃持续15 s，72 ℃持续 15 s。相关引物均由上海生工合成(表1)。

1.7 Western blot检测 取小鼠肝脏组织，液氮速冻后研磨并使用RIPA裂解液提取组织蛋白。用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度后定量30 μg蛋白。随后进行蛋白电泳及转膜，结束后将PVDF膜在室温封闭1 h，接下来按照1∶1000的浓度配置一抗：AMPK、p-AMPK、ACC和p-ACC，4 ℃孵育过夜。次日将PVDF膜在二抗中室温孵育1 h，使用TBST洗膜3次后使用显影剂观察条带上蛋白的表达情况。具体实验步骤参照文献[9]。

2 结 果

2.1 CBD对老龄小鼠代谢特征的影响 HFD组的血糖水平、胰岛素水平、TG、TC、FFA、ALT和AST的含量相比于NC组小鼠均显著升高(<0.05)，CBD组的上述代谢相关参数的水平显著减低，提示CBD能改善HFD小鼠的糖脂代谢紊乱(表2)。

2.2 CBD对老龄小鼠肝脏脂肪变性的影响 油红O染色发现，与NC组小鼠比较，HFD组小鼠肝脏细胞内存在明显脂滴，CBD组红染脂滴数量明显变少，提示CBD可以减轻HFD小鼠的肝脏脂肪变性(图 1)。

2.3 CBD对老龄小鼠葡萄糖处理能力的影响 IPGTT和ITT实验结果显示，与NC组小鼠相比，HFD组小鼠葡萄糖和胰岛素耐量受损，CBD干预能够部分恢复高脂饮食小鼠的葡萄糖处理能力(图2)。

2.4 CBD调节老龄小鼠脂质代谢相关基因mRNA表达 qRT-PCR检测脂代谢相关基因的mRNA表达水平(表3)，与NC组小鼠相比，HFD组小鼠中脂肪生成相关基因：FAS和 SREBP1c表达水平均显著上调，CBD干预显著降低了FAS和SREBP1c的mRNA表达水平。HFD组小鼠参与脂质分泌的基因ApoE及与脂肪氧化相关的PPARα及CPT1a的表达受到抑制，CBD能增加这些基因的mRNA表达水平。

2.5 CBD激活AMPK/ACC信号通路 Western blot检测三组老龄小鼠中p-AMPK及p-ACC蛋白的表达情况(图3)。在HFD组小鼠中，p-AMPK及p-ACC蛋白表达水平显著降低(<0.05)。CBD干预后，与HFD组相比，p-AMPK及p-ACC蛋白的表达水平显著升高(<0.05)。

3 讨 论

随着我国人民生活水平的显著提高，NAFLD的发病率逐年增高，已取代慢性乙型肝炎成为第一大慢性肝脏疾病。肝脏脂肪变性是NAFLD的初始病理阶段，尚无明确有效的治疗药物。本研究发现，CBD可以显著改善老龄小鼠中糖脂代谢相关参数，降低胰岛素敏感性，降低肝细胞中的脂质积累，进而减轻小鼠肝脏脂肪变性。同时，CBD改善脂质代谢相关mRNA的表达水平，提高AMPK和ACC的磷酸化水平，表明CBD对老龄小鼠肝脏脂肪变性的发挥，AMPK/ACC信号通路参与了这一过程。

糖脂代谢紊乱是代谢综合征的重要临床表现，与胰岛素抵抗、血脂异常显著相关。在本研究中，我们检测了不同组间小鼠糖脂代谢相关参数的变化，结果表明，CBD显著降低了HFD老龄小鼠的血糖水平、胰岛素含量、TG、TC、FFA、ALT及AST的水平。同时，CBD干预提高了HFD老龄小鼠对葡萄糖的处理能力，改善胰岛素抵抗。

脂代谢涉及脂质合成、分泌和氧化分解等过程。在脂质合成代谢中， SREBP-1c是调节与肝脏脂肪合成相关酶的活性和表达的关键转录因子，其能促进脂肪酸合成代谢。FAS是体内合成内源性脂肪酸的关键酶之一， 能被SREBP-1c激活，将多余的能量以三酰甘油的形式储存在脂肪组织中，进而促进肝脏脂肪合成。在脂质分解代谢中，PPARα则能通过激活脂肪氧化基因的表达促进脂肪酸氧化，从而促进脂肪的降解，其表达的异常与许多脂代谢性疾病有关。CPT1a 能与长链脂酰辅酶A合成脂酰肉碱，并将其转运至线粒体而促进其氧化分解。 ApoE是血浆中重要的载脂蛋白，具有转运胆固醇，调节脂类代谢的作用。在本实验中，qRT-PCR显示HFD老龄小鼠中SREBP-1c及FAS的表达水平显著升高，而PPARα、CPT1a及ApoE的转录水平被显著抑制，表明经高脂饮食喂养的老龄小鼠，脂肪合成被活化而脂肪分解代谢被显著抑制。CBD干预能显著降低SREBP-1c及FAS，并提高PARPα、CPT1a及ApoE的mRNA表达水平，证明在HFD老龄小鼠中，CBD的干预能抑制脂质合成代谢并促进脂质分解代谢相关基因的表达。

ACC也是脂肪酸合成的关键酶，能被SREBP-1c激活，促进脂质合成并抑制脂肪酸氧化。AMPK信号通路是脂质代谢的重要通路， AMPK在调控ACC活性中具有关键作用。AMPK经磷酸化激活后，进一步磷酸化ACC，而ACC被AMPK磷酸化后失去活性，进而促进脂质的线粒体氧化，减少脂质的沉积。本研究通过Western blot实验观察到，在HFD小鼠中，APMK和ACC的磷酸化水平受到抑制，而CBD干预促进了p-AMPK和p-ACC的表达水平，表明CBD能激活AMPK并使下游的ACC失去活性，进而减轻高脂喂养的小鼠的肝脏脂肪变性。这些结果表明，APMK/ACC信号通路参与了CBD干预改善HFD小鼠的肝脂肪变性的过程。

综上所述，CBD能改善高脂饮食小鼠中糖脂代谢相关参数的紊乱，减轻高脂饮食的胰岛素抵抗和肝脏脂肪变性，对APMK/ACC通路的激活作用可能是其发挥肝脏保护作用的潜在机制。本研究仍具有一定的局限性。CBD主要通过CBD受体CB1和CB2发挥胞内作用，但本研究未探讨CBD受体在CBD缓解高脂饮食老龄小鼠肝脏脂肪变性中的作用，未采用AMPK抑制剂反证AMPK/ACC信号通路的作用，课题组将在下一步研究中继续上述工作。