杨洁真，王 晶，宋永红，唐 勤，吴 强,3

卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，其病死率位居女性恶性肿瘤第五位[1]。导致卵巢癌病死率较高的主要原因之一是肿瘤复发后对化疗药物的耐药，耐药不仅限制了卵巢癌复发患者的二次手术机会，对晚期卵巢癌的初次减瘤手术也有较大的影响，因此寻找降低卵巢癌化疗耐药性的治疗方案是目前研究热点之一[2-3]。中药有效成分联合传统化疗药物，能增强肿瘤细胞对药物的敏感性，降低肿瘤细胞对一线化疗药物的耐药程度[4]。莪术醇是衡量中药莪术油药效的重要指标之一，课题组前期利用脂质体运载莪术醇，发现脂质体莪术醇(liposome curcumol, LC)能有效发挥抗卵巢癌作用[5]，并且与顺铂联合使用后能提高卵巢癌细胞对顺铂的敏感性，促进其凋亡[6]。但是LC是否能够降低卵巢癌细胞对顺铂的耐药程度，目前未见报道。

1 材料与方法

1.1 材料人卵巢癌细胞株SKOV3(上海赛百慷生物技术股份有限公司)；卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP由安徽医科大学基础医学院实验室提供; 脂质体莪术醇(由合肥工业大学合成)；顺铂(D109812)、氯化铟(I196212)、二乙基二硫代氨基甲酸钠(DDTC, S302932)(上海阿拉丁试剂有限公司)；乙腈(A955-4，美国ThermoFisher公司)；凋亡试剂盒(上海贝博生物科技有限公司)；利福平(沈阳红旗制药有限公司)；CCK-8试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；β-actin(66009-1g)、Anti-P Glycoprotein(P-gp，22336-1-AP)(美国proteintech公司)；辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠、抗兔(北京中杉金桥生物技术有限公司)；逆转录和qPCR 试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)；qRT-PCR引物(安徽通用生物股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 人卵巢癌细胞株SKOV3用含10%胎牛血清的McCoy’s 5A培养，SKOV3/DDP在常规培养基中加入200 ng/ml顺铂，37 ℃、5% CO2条件下培养，使用前在无顺铂常规培养基中培养一周。

1.2.1.1细胞分组 SKOV3/DDP细胞分成：① 空白对照组：常规培养基；② 阴性对照组：含12.5 μg/ml脂质体培养基；③ 顺铂组：含4 μg/ml顺铂的培养基培养24 h；④ LC组：含20 μg/ml的LC培养基培养48 h；⑤ 联合组：含顺铂(4 μg/ml)+LC(20 μg/ml)的培养基， 细胞先用含20 μg/ml的LC培养基培养24 h，再与含顺铂(4 μg/ml)+LC(20 μg/ml)的培养基培养24 h。

1.2.1.2激动剂分组 ① 利福平组：用培养基稀释利福平粉末，配成10 μmol/L的溶液，培养细胞24 h；② 利福平+顺铂组: 用含利福平(10 μmol/L)+顺铂(4 μg/ml)的培养基培养24 h；③ 利福平+LC组: 细胞先与含利福平(10 μmol/L)+LC(20 μg/ml)的培养基培养24 h, 再与20 μg/ml的LC培养基培养24 h；④ 利福平+LC+顺铂组: 细胞先与含20 μg/ml的LC+利福平(10 μmol/L)培养基培养24 h, 再与含LC(20 μg/ml)+顺铂(4 μg/ml))的培养基培养24 h。

1.2.2CCK-8法测细胞活力 在各组细胞中，加入CCK-8溶液10 μl/孔，37 ℃培养2 h，用酶标仪检测450 nm波长吸光度，实验重复三次。细胞活力=(实验组-无细胞培养基组)/(对照组-无细胞培养基组)×100%。使用Graphpad回归模型计算半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。

1.2.3液相色谱-串联质谱(HPLC-MS)测定细胞内顺铂含量 各组取细胞沉淀，用超声裂解后制备顺铂衍生物，细胞悬液加内标氯化铟，加5% DDTC溶液，45 ℃孵育20 min，加300 μl乙腈混匀，离心取上层溶液过滤，用HPLC-MS测定细胞内顺铂平均含量(顺铂平均含量用顺铂衍生物与内标铟峰面积的比值/细胞数表示)。色谱柱：Thermo Syncronis C18柱(1 μm×2.1 mm×100 mm)；流动相A相为乙腈，B相为0.1%甲酸水。质谱条件：离子源：HESI源；喷雾电压：4 000 V(+)；离子化模式：ESI+；毛细管温度：320 ℃；扫面模式：选择离子监测SIM模式，铂的衍生物：C15H29N3S6Pt ([M+H]+=639.04062)，内标铟的衍生物：C10H19N2S4In ([M+H]+=410.95426)。

1.2.4流式细胞仪检测细胞凋亡 不含EDTA的胰酶消化、收集各组细胞后，加入400 μl的AnnexinV结合液重悬细胞，再加入5 μl AnnexinV染色液室温避光孵育15 min，然后加入5 μl的碘化丙啶孵育5 min，最后使用流式细胞分析仪检测样本，用CytExpert软件进行分析。

1.2.5qRT-PCR检测P-gp mRNA相对表达量 收集各组细胞，利用Trizol提RNA，使用诺唯赞逆转录试剂将总RNA逆转录成cDNA，按照qPCR试剂盒说明进行引物扩增，最终数据以2-ΔΔCt值进行计算。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.6Western blot检测P-gp蛋白表达情况 提取各组细胞总蛋白，用BCA试剂盒检测蛋白浓度，10% SDS-PAGE凝胶，200 mA、140 min转移到PVDF膜，封闭，加一抗P-gp(1 ∶1 000)，4 ℃摇床孵育过夜，加入二抗室温孵育1.5 h，ECL进行发光反应，β-actin作为内参，使用ImageJ软件进行灰度分析。

1.2.7免疫细胞化学检测P-gp蛋白表达情况 常规准备细胞爬片，甲醛固定，用0.2% TxitonX-100处理5 min，3% H2O2处理5 min，加入一抗P-gp(1:400)4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育30 min，DAB显色，苏木精复染，脱水透明后加封片剂封片。

1.3 统计学处理使用 Prism 8.0 进行统计分析，数据以表示。通过未配对的t检验分析两组之间的差异，多组均数间的比较采用单因素方差分析及其两两比较方法LSD法，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 顺铂联合LC对SKOV3/DDP细胞增殖的影响如图1A所示，与不同浓度顺铂培养后，SKOV3/DDP的细胞活力(FSKOV3/DDP=220.6,IC50=28.36±2.71 μg/ml,P<0.05)高于SKOV3细胞(FSKOV3=573.0,IC50=7.64±0.58 μg/ml,P<0.05)。图1B所示，与不同浓度LC培养后，SKOV3/DDP细胞活力呈浓度梯度依赖性降低(F=989.1,P<0.05)，IC50为(126.8±5.07)μg/ml，当LC药物浓度为20 μg/ml时，细胞活力值为90%以上，因此在后续研究中以LC药物浓度20 μg/ml为标准。图1C所示，与顺铂组相比，联合组细胞活力呈顺铂浓度梯度依赖性地降低(F顺铂组=340.8vsF联合组=363.7，P<0.05)，当顺铂浓度为4 μg/ml时，联合用药能抑制SKOV3/DDP细胞的增殖(P<0.05)。图1D提示，不同浓度的裸脂质体对SKOV3/DDP细胞活力无明显的抑制作用。

图1 顺铂与LC联合用药对SKOV3/DDP细胞活力的影响

2.2 LC对SKOV3/DDP细胞内顺铂平均含量的影响如表2所示，顺铂组和联合组细胞内顺铂平均含量呈时间梯度依赖性增高，联合组细胞内顺铂平均含量高于单用顺铂组，差异有统计学意义。

表2 顺铂组与联合组在不同时间点SKOV3/DDP细胞内的顺铂含量

2.3 顺铂与LC联合用药对细胞凋亡的影响与对照组(4.62%±1.32%)相比，顺铂组(23.11%±2.96%)和联合组(54.34%±3.37%)凋亡率均增加，联合组细胞凋亡率在四组中最高(F=242.0，P<0.05)，见图2。

图2 顺铂与LC联合用药对细胞凋亡的影响

2.4 LC通过抑制P-gp蛋白表达逆转SKOV3/DDP细胞对顺铂的耐药性如图3A所示，与SKOV3相比，SKOV3/DDP细胞中P-gp蛋白表达水平上升(t=14.08,P<0.05)。如图3B所示，LC作用48 h能抑制SKOV3/DDP细胞中P-gp蛋白的表达量(F=80.46,P<0.05)。如图3C和D所示，与顺铂组相比，联合用药组P-gp mRNA和蛋白的相对表达水平下降(FmRNA=115.5,F蛋白=258.4,P<0.05)。免疫细胞化学结果显示，联合用药能抑制P-gp蛋白在SKOV3/DDP细胞的胞质和胞膜中的表达(图3E)。

图3 LC通过抑制P-gp蛋白表达逆转SKOV3/DDP细胞的顺铂耐药

2.5 P-gp活性激动剂可逆转LC介导的P-gp蛋白表达Western blot结果提示，P-gp活性激动剂利福平能促进SKOV3/DDP细胞中P-gp蛋白的表达，并部分恢复联合用药后SKOV3/DDP细胞P-gp蛋白的表达 (F=41.43,P<0.05)。

3 讨论

卵巢癌的发病率大约在5%，但其病死率位居女性生殖系统恶性肿瘤首位[1]。在卵巢癌临床治疗中，化疗药物的使用显著延长了肿瘤患者的生存年限[7]。然而，化疗耐药的出现严重制约了化疗的效果，甚至导致治疗的失败。因此，如何逆转卵巢癌细胞顺铂耐药成为改善卵巢癌患者预后的关键环节。在本研究中，以前期研究为基础，发现脂质体莪术醇联合顺铂可明显降低卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP细胞活力，促进凋亡，降低细胞中P-gp蛋白的表达，增强SKOV3/DDP细胞对顺铂的敏感性。

多药耐药(multidrug resistance, MDR)作为耐药机制中最常见的原因之一，主要涉及腺苷三磷酸(ATP)结合盒转运体(ATP-binding cassette, ABC)超家族，其能将多种物质跨膜转运，保护机体免受有毒代谢物和化合物的伤害。ABC外排转运体在肿瘤细胞中过表达能够限制化疗药物的长期有效使用，形成MDR[8]。P-gp是ABC转运蛋白B亚族，为MDR1的表达产物。化疗后，肿瘤细胞内P-gp表达升高，其通过与化疗药物结合，由ATP供能将细胞内药物泵出细胞外，促使细胞内药物浓度降低，从而产生耐药[8]。本研究发现，卵巢癌细胞中，相比于SKOV3，SKOV3/DDP中的 P-gp 蛋白表达水平明显上调。联合用药组P-gp的mRNA和蛋白表达水平下调。这与Gao et al[9]研究一致，P-gp在卵巢癌细胞中的表达水平与肿瘤的多药耐药呈正相关，P-gp促进细胞将各种化疗药物外排导致卵巢癌患者的多药耐药。

大量研究发现，莪术醇作为中药莪术挥发油中提取的有效单体成分，具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤作用[10]，当与化疗药物联用时，可增强化疗疗效并对肿瘤细胞有杀伤作用[11]。Huang et al[12]研究表明，莪术醇可通过抑制PI3K/AKT通路激活，提高人胃癌细胞对顺铂的敏感性。莪术醇通过靶向miR-181b-2-3p-ABCC3轴抑制三阴性乳腺癌增长，增强其对阿霉素的敏感性[13]。课题组前期研究[6]发现，LC可通过抑制PI3K/AKT信号通路激活，进一步增强顺铂抗卵巢癌作用，并降低顺铂的IC50。在本研究中，通过HPLC-MS检测细胞内顺铂平均含量[14]，发现顺铂联合LC用药促进细胞内顺铂平均含量的增高。实验发现，LC作用48 h对SKOV3/DDP细胞的P-gp表达抑制效果最佳，但是临床顺铂常用一日方案，因此我们在设计联合用药方案时，将 LC与细胞先培养24 h后，再与顺铂联合作用24 h，这为药物将来的临床转化提供理论依据。

图4 P-gp活性激动剂(利福平)影响LC抑制SKOV3/DDP细胞P-gp蛋白的表达量

综上所述，本研究发现顺铂与LC联合用药能增强SKOV3/DDP细胞对顺铂敏感性，该作用可能与抑制P-gp蛋白表达、增加细胞内顺铂的药物平均含量有关。该研究为耐药卵巢癌的治疗提供新的思路，但是联合用药降低卵巢癌对顺铂耐药的机制需要进一步深入研究。