王 芳，包怡红，兰慧娟

1 北大荒完达山乳业股份有限公司质检中心，黑龙江哈尔滨 150078

2 东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨 150000

0 引言

维生素D3也叫脂溶性维生素，可调节细胞生长分化和人体免疫功能，有利于新骨发育和钙化，可促进骨骼生长，预防骨质疏松症[1～3]。对于婴幼儿的生长发育，维生素D3是必不可少的营养元素，也是婴幼儿配方奶粉（简称“婴配粉”）中必须要添加的营养物质。其在受温度及光作用下会变得不稳定易分解，因此研究在不同贮藏条件下维生素D3的稳定性非常必要[4～8]。本文采用《GB 5009.82—2016 食品安全国家标准 食品中维生素A，D，E的测定》第四法食品中维生素D的测定——高效液相色谱法比较3 种婴配粉中脂溶性维生素D3在不同温度的贮藏过程中的含量变化情况，以优化贮藏条件，减少对脂溶性维生素D3含量的影响。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

高效液相色谱仪（紫外检测器），美国Perkin Elmer股份有限公司；分析天平（感量0.1 mg），梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司；水浴磁力恒温搅拌器，常州华奥仪器制造有限公司；萃取净化振荡器、氮吹仪，北京同泰联科技发展有限公司；旋转蒸发仪、涡旋混合器，德国IKA集团。

1.1.2 试剂

氢氧化钾溶液；称取500 g氢氧化钾，加入400 mL水溶解，冷却后，储存于聚乙烯瓶中；半制备维生素D流动相：环己烷∶正己烷（1∶1）并按体积分数0.8%加入异丙醇；流动相：甲醇（色谱纯）。

维生素D3标准品：购买经国家认证并授予标准物质证书的维生素D3标准品（纯度≥99%）配制维生素D3储备液（1 000 μg/mL）和维生素D3工作液，浓度分别为0.06 μg/mL、0.12 μg/mL、0.24 μg/mL、0.36 μg/mL、0.48 μg/mL、0.60μg/mL。

1.2 试验步骤

1.2.1 试验方法

随机选取超市中3 种不同品牌的幼配粉（12～36 个月），每个品牌4 个样品，在阴凉干燥处（0~4 ℃）、常温（18~20 ℃）、低温（-18 ℃）及高温（30 ℃）4 种贮藏条件下，分别储存4 周，每周测定1 次维生素D3含量变化。

1.2.2 样品处理

（1）皂化

称取5 g（精确至0.01g）经均质处理的试样于150 mL平底烧瓶中，试样需加入约20 mL温水，混匀，再加入1.0 g抗坏血酸和0.1 g 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚，混匀，加入40 mL无水乙醇，加入10 mL氢氧化钾溶液，边加边振摇，混匀后于60 ℃恒温水浴震荡皂化45 min，皂化后立即用冷水冷却至室温。

（2）提取

将皂化液用30 mL蒸馏水转入250 mL的分液漏斗中，加入50 mL石油醚，振荡萃取5 min，将下层溶液转移至另1 个250 mL的分液漏斗中，加入50 mL的石油醚再次萃取，合并醚层。

（3）洗涤

用约100 mL水洗涤醚层，约需重复3 次，直至将醚层洗至中性（可用pH试纸检测下层溶液pH值），去除下层水相。

（4）浓缩

将洗涤后的醚层经无水硫酸钠（约3 g）滤入250 mL旋转蒸发瓶中，用约15 mL石油醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠2 次，并入蒸发瓶内，并将其接在旋转蒸发仪上于40 ℃水浴中减压蒸馏浓缩，待瓶中醚液剩下约2 mL时，取下蒸发瓶，立即用氮气吹至近干。用正己烷定容至2 mL，0.22 μm有机系滤膜过滤供半制备正相高效液相色谱系统使用的净化待测液[9]。

1.2.3 色谱条件

（1）半制备正相高效液相色谱条件：a）色谱柱：硅胶柱，柱长250 mm ，内径4.6 mm，粒径5 μm；b）流速：1 mL/min；c）波长：264 nm。d）柱温：25 ℃；e）进样体积：500 μL。

（2）半制备正相高效液相色谱系统适用性试验：取约1.00 mL维生素D3标准溶液中间液于10 mL试管中，在40 ℃的氮吹仪上吹干。用10 mL正己烷振荡溶解。取该溶液500 μL进行正相液相色谱仪测定，确定维生素D3保留时间。然后将500 μL待测液注入液相色谱仪中，根据维生素D3标准溶液保留时间收集维生素D3馏分于试管中。将试管置于40 ℃水浴氮气吹干，取出准确加入1.5 mL甲醇振荡溶解，即为维生素D3测定液。

（3）反相液相色谱条件：a）色谱柱：C18柱（柱长250 mm，内径4.6 mm，粒径5 μm）；b）柱温：25 ℃；c）流动相：甲醇；d）流速：1.0 mL/min；e）紫外检测波长：维生素D3为264 nm；f）进样量：维生素D3为100 μL。

1.2.4 结果计算

试样中维生素D的含量按下式计算：

X：试样中维生素D2/D3的含量，单位为微克每百克（μg/100 g）；C：根据标准曲线计算得到的试样中维生素D2/D3的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；V：正己烷定容体积，单位为毫升（mL）；f：待测液稀释过程的稀释倍数；100：试样中量以每100 g计算换算系数；m：试样的称样量，单位为克（g）；计算结果保留三位有效数字[10，11]。

2 结果分析

2.1 标准曲线、检出限及样品定量重复性

根据《GB 5009.82—2016 食品安全国家标准食品中维生素A、D、E的测定》（第四法 食品中维生素D的测定 高效液相色谱法）的要求，测量范围应覆盖方法的最低浓度水平（定量限）和关注浓度水平，确定维生素D3标准曲线浓度范围为0.0101 μg/mL，0.0253 μg/mL，0.1012 μg/mL，0.2024 μg/mL，0.3036 μg/mL，0.5060 μg/mL（浓度均经过分光光度计校正）测定标准曲线，每一点浓度测定3次，使用3 次数据拟合得到线性参数，各浓度点对应的浓度和峰面积见表1。

表1 维生素D3标准溶液浓度与对应峰面积

从试验结果可见，得出维生素D3的拟合标准曲线的线性方程为Y=3.3608X+0.0388，此时R2=0.999 1，大于0.99，浓度范围覆盖关注浓度的0%~150%，满足《GB/T 27417—2017合格评定化学分析方法确认和验证指南》的要求。

采用标准偏差法，选择阴性样品（即试样中本身不含有维生素D3）试样，称取10 份，每份称取10.0 g左右，按标准方法进行检测，按LOD的表示方法为3 s（表），LOQ为3 倍的LOD。

从试验结果可见，称样量为10.0 g，定容体积为2 mL时，方法检出限为0.303 μg/100 g，方法定量限为0.909 μg/100 g）。低于该方法规定的检出限和定量限（称样量为10 g，定容体积为2 mL时，方法检出限为0.7 μg/100g，方法定量限为2 μg/100g）。

图1 维生素D3标准溶曲线

2.2 不同储存时间维生素D3含量变化

选取的婴配粉在4 种贮藏条件下，贮存4周，每周测定1 次维生素D3含量变化，结果如图3所示。

图3 不同品牌贮存期维生素D3含量变化

不同品牌在不同贮藏温度下维生素D3含量有所不同，3 种品牌最初测定维生素D3含量分别为6.31 μg/100 g、6.20 μg/100 g、6.00 μg/100 g，由图所示，在阴凉干燥处（4 ℃）、常温（20 ℃）下，维生素D3含量随时间变化较小，可忽略不计；在低温（-18 ℃）及高温（30 ℃）下，维生素D3含量随时间变化含量有所下降。以上表明低温和高温均会对维生素D3含量有所影响，不利于奶粉贮藏。综上所述，维生素D3贮藏最佳条件为阴凉干燥处[12，13]。

表2 维生素D3方法检出限与定量限结果

3 小结

本文主要研究结果显示，婴配粉中的维生素D3含量在阴凉干燥环境下和常温环境下几乎没有变化，但低温和高温均会影响维生素D3的含量，主要原因可能是低温或高温条件可引起维生素D3分解，导致其含量减少。维生素D3含量随外界贮藏条件的变化在未来几年仍将是受关注的研究领域[14]。