王振宇，王泽青，刘占宏，满金龙，孙世峰，李红魁，吕晓惠，王志学＊

1 辽宁科技学院生物医药与化学工程学院辽宁省生物医药重点实验室，辽宁本溪 117004

2 辽宁省农产品及兽药饲料产品检验检测院，辽宁沈阳 110053

3 辽宁省无抗养殖科技院，辽宁沈阳 110000

4 辽宁辉山乳业集团孙家牧业有限公司，辽宁沈阳 110164

5 辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳 110161

0 引言

奶牛乳房炎严重影响奶业生产[1]，并造成巨大经济损失[2]，一是导致奶牛淘汰而造成的奶牛育成成本损失；二是导致产奶期提早结束而带来的饲养成本损失；三是导致乳区永久性失去功能而造成的产能减少损失。目前，奶牛乳房炎治疗主要依靠抗生素加地塞米松等[1]，但这会造成牛奶中抗生素残留，并且间接危害人体健康。因此，奶业生产中亟需无抗治疗奶牛乳房炎的药物。中医药典籍中，如《太平惠民和剂局方》《外科正宗》和《中兽医手册》中有很多治疗人类通乳消痈和动物乳房炎的理论[3~5]。本试验尝试使用以青皮、柴胡和黄芪等为主要成分的中兽药散剂，对奶牛场中患有乳房炎的产奶期奶牛进行治疗，并通过考察奶牛乳房炎病程情况、奶牛免疫情况和牛奶品质等，综合评估中兽药散剂的治疗效果。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物

辽宁省沈阳市法库县某奶牛场的患临床型乳房炎的荷斯坦牛，试验前未进行过任何治疗。

1.1.2 仪器和试剂

牛血细胞因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）酶联免疫分析试剂盒，酶免公司；光学显微镜（CX33），奥林巴斯公司；酶标仪（Thermofisher Multiskan FC），赛默飞世尔中国；双人单面垂直净化工作台（SW-CJ-2D），苏州博莱尔净化设备有限公司；冷藏柜（SC-320D），海尔集团有限公司；电子天平（JA2003），上海浦春计量仪器有限公司。

中兽药散剂（300 g/份）包含柴胡40 g、黄芩 40 g、青皮 30 g、黄芪 40 g、生地40 g、丹参 40 g、枳实10 g和蒲黄5 g等，炮制方法参考专利[6]。

1.2 试验方法

1.2.1 试验分组

从患临床型乳房炎的奶牛中随机选取20 头（金黄色葡萄球菌感染所致），分为2 组（每组10头），空白对照组和治疗组。空白对照组：不进行任何治疗；治疗组：使用中兽药散剂治疗，每头奶牛灌服中兽药散剂300 g/天。试验周期为12 天。试验期间，观察奶牛状态并记录。

1.2.2 取样检测

（1）血液样本

使用真空采血管采集奶牛尾静脉血液样本，进行白细胞计数、粒细胞和淋巴细胞含量检测和IL-1β、IL-6和TNF-α含量检测。

白细胞计数。取20 μL血液样品放入0.38 mL白细胞计数稀释液[2%冰乙酸（冰乙酸2 mL、蒸馏水98 mL、10 g/L亚甲蓝溶液3 滴]，滴入血细胞计数板中，在显微镜下计算白细胞总数。

粒细胞和淋巴细胞含量检测。制备血涂片后，经滴加瑞士染液染色、磷酸缓冲液冲洗和干燥后，镜检并记录粒细胞和淋巴细胞比例情况。

IL-1β、IL-6和TNF-α含量检测。按照牛血细胞因子酶联免疫分析试剂盒说明书，分别检测奶牛血液中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。

（2）牛奶样品

体细胞数测定。试验中采用加利福尼亚测试（CMT）判断奶牛乳房炎病程情况[7]。按照CMT法的判定标准，用阴性（t）、可疑（n）、弱阳性（1）、阳性（2）和强阳性（3）表示奶牛乳房炎病程情况。

1.3 结果判定和数据处理

治愈奶牛的判定：奶牛行为正常，乳区通畅且无红、肿、热、痛等炎症反应，且无复发现象。同时，牛奶中的凝块、絮状物消失，牛奶色泽和产量恢复正常。

治愈率（%）=（治愈奶牛数/治疗的奶牛总数）×100%。

数据处理：应用SPSS18.0软件中的T检验功能，分别分析两个试验组间白细胞总数、粒细胞和淋巴细胞比例、细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量之间的差异性，P<0.05为差异显著。

2 结果

2.1 奶牛乳房炎病程情况

如表1所示，试验初始时，治疗组和空白对照组中奶牛所产牛奶经CMT方法判断体细胞数高于正常水平，表明奶牛患有不同程度的乳房炎，并且显示部分奶区堵塞的奶牛乳房炎病情较重。经过中药散剂治疗7 d时，治疗组中所有奶牛的乳区全部恢复通畅，显示中药散剂具有较好的通乳作用。治疗12 d时，治疗组中，9 头奶牛牛奶的CMT检测呈阴性，显示牛奶中体细胞数恢复至正常水平，即这9头奶牛乳房炎被治愈，1 头为CMT检测弱阳性，显示奶牛乳房炎病情较初始时得到缓解，治愈率达90%。空白对照组中，经过12 d喂养后，除1 头奶牛乳房炎自愈外，其余奶牛乳房炎未见好转，2 头奶牛新增乳区堵塞情况即乳房炎病情加重。以上结果显示，中药散剂可使奶牛被堵塞奶区恢复通畅，并减少牛奶体细胞数，缓解奶牛乳房炎。

表1 奶牛乳区通畅情况和乳房炎病程情况

2.2 奶牛免疫情况

由图1A可知，治疗组中，在治疗的3 d至5 d，奶牛白细胞总数逐渐增加至1 d时的约145%，而后逐渐降低（12 d时降低至1 d的53%）；对照组中，未进行任何治疗和处理，奶牛白细胞总数波动很小。以上结果显示，中兽药散剂可对奶牛白细胞数量产生影响。

图1奶牛血液中白细胞含量及粒细胞和淋巴细胞占比

由图1B和图1C可知，中药散剂治疗对奶牛粒细胞和淋巴细胞比例影响较大。在治疗组中，1 d至5 d，中药散剂将奶牛血液中粒细胞比例由2%以下，提升至33.6%；7 d至12 d，粒细胞比例先增至46.3%，后降低到32.7%。在对照组中，奶牛白细胞、粒细胞和淋巴细胞比例波动较小。其中，淋巴细胞比例为64.6%~80.4%，粒细胞比例为小于18.3%。以上结果显示，中兽药散剂可对奶牛血液中粒细胞和淋巴细胞比例产生影响。

由图2可知，对照组奶牛血液中IL-6和TNF-α含量在试验期间波动较小，IL-1β含量逐步增加（12 d时，较初始值增加51.8%）；而治疗组奶牛血液中，IL-1β、IL-6和TNF-α含量变化均呈现出，先降低，后逐步增加的现象，即炎症因子水平先降低，后逐步恢复。在治疗组中，在3 d时，奶牛血液中TNF-α达到最低水平，较未治疗前降低了69.2%；在5 d时，奶牛血液中IL-1β含量下降到最低，较未治疗前降低了71.0%；在7 d时，奶牛血液中IL-6含量下降到最低，较未治疗前降低了66.3%。以上结果显示，中兽药散剂可对奶牛血液中炎症因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）水平产生影响。

图2 奶牛血液中IL-1β、IL-6和TNF-α含量

3 讨论

3.1 奶牛乳房炎治疗情况分析

乳房炎，又名乳痈，是母畜乳房出现臃肿，肿痛，乳汁不畅，乳汁变性的疾病[5]。乳痈多因肝气郁结，乳汁淤积不通，邪气化热，进而邪毒与积乳互结，阻于乳络，也可发为痈肿[8，9]。朱震亨[10]认为可用青皮治疗乳痈。陈修园[11]认为柴胡等可疏肝理气，治疗乳痈。依据前人理论和实践，本试验中乳房炎奶牛的通乳治疗效果（表1），显示中药散剂中青皮和柴胡对奶牛乳房炎治疗产生了积极效果。

经过为期12 d试验，治疗组中9 头奶牛乳房炎痊愈，1 头奶牛的乳房炎症状得到缓解，治愈率达到95%，这显示中药散剂对奶牛乳房炎具有很好疗效；对照组奶牛，除1头在3 d时自愈外，其余奶牛乳房炎症状不同程度恶化，但没有威胁奶牛生命。推测，中药散的疗效应来自于其中青皮、柴胡和茯苓等药材的治疗作用。

由表1可知，中药散剂可以在7 d内通乳消痈，这显示其具有疏通奶牛堵塞奶区的功能。奶区堵塞的原因可能是，乳腺细胞纤维化和乳腺细胞发炎肿胀导致的乳汁分泌功能障碍，以及细菌产生的菌膜堵塞乳腺。推测中药中所含生物活性成分可以起到通乳消痈的作用。首先，柴胡所含山柰酚可以有效抑制机体细胞的纤维化[12]，推测可以帮助乳腺细胞恢复分泌功能，并对通乳起到了一定作用。其次，青皮、柴胡和黄芩中含有较多的多烯类物质、黄酮类物质和部分醇类物质[13~15]，这些生物活性成分具有较好的抗炎和抗菌活性。例如，青皮中含有的D-柠檬烯，可调节iNOS、COX-2、PGE2、TGF-β和ERK1/2信号通路降低炎症因子的表达水平，产生抗炎作用[14]。柴胡中黄酮类物质，如柴胡皂苷A和D等具有抗炎作用，可通过抑制炎症介质的作用以及刺激内源性糖皮质激素的释放，起到抗炎作用[13]。同时，柴胡中所含有的法尼醇，可以对抗金黄色葡萄球菌、杜布兰念珠菌和白色念珠菌引起的感染，并可以阻止病原菌形成菌膜[16，17]。因此，推测中药散剂可能通过抑制奶牛乳腺细胞纤维化、抗炎和拮抗病原菌，达到治疗奶牛乳房炎的效果。

3.2奶牛免疫情况分析

本试验中，奶牛血液中白细胞总数（图1A）、粒细胞和淋巴细胞比例（图1B和C），以及细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α含量（图2）的变化情况，表明中药散剂可以调节奶牛免疫功能。

第一，中药散剂中含有黄芪，可以增加T和B淋巴细胞的增殖和抗体的产生，同时还可以抑制腹腔巨噬细胞IL-1和TNF-α的产生[18]。本试验治疗中前期（3~7 d）观察到的结果与该报道一致。而散剂中柴胡所含有的多糖成分，可以增强细胞吞噬活性和抑制炎症的作用[19]。推测，中药散剂可以提高奶牛免疫功能。

第二，白细胞中粒细胞对抗病原菌能力较强，而淋巴细胞拮抗病毒能力较强。图1显示，中药散剂可显著增加粒细胞占比，进而增强奶牛对抗病原菌感染的能力。同时，淋巴细胞占比相对减少，因此渗入到牛奶中的数量也会减少。推测，表1中治疗组的牛奶所含体细胞数量减少可能与此有关。

第三，IL-1β、IL-6和TNF-α是导致乳房炎发病及病程进展的主要炎症因子[20，21]。在治疗的3~7 d，奶牛血液中IL-1β、IL-6和TNF-α含量分别降低至1 d值的64.8%~71.0%（图2），显示中药散剂有效降低了炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量，即有效抑制了以上细胞因子介导的炎症反应，从而有效治疗奶牛乳房炎。

第四，《局方》“神效托里散”和《外科正宗》“透脓散”，认为黄芪可作为主药治疗“乳痈”或“痈疽诸毒内脓已成，不穿破者”[3，4]。依据前人理论和实践，黄芪能够治疗“痈疽诸毒内脓”等症状，可能是治疗药物中含黄芪，可以降低细胞炎症因子水平，起到消炎作用（图2）。

另外，奶牛血液中白细胞总数先增加后降低至略低于初始值的现象，以及IL-1β、IL-6和TNF-α的含量在达到最低后逐步升高的情况（图2），可能表明奶牛机体在经过初期中药散剂治疗后，逐步适应了其作用，而后逐步形成新的免疫稳态，这也显示中药散剂治疗具有安全性。

4 小结

综上所述，试验表明中药散剂可以通乳消痈，使其产奶恢复正常。同时，中药散剂可有效减少牛奶中体细胞数量；可增加奶牛白细胞中粒细胞在白细胞中的比例，提升奶牛抵抗病原菌感染的能力；可以降低IL-1β、IL-6和TNF-α含量，抑制奶牛炎症反应。因此，可推测中药散剂可以通过调节奶牛免疫功能，通乳消痈，并达到治疗奶牛乳房炎的目的。