王雪儿，王 玲，杨欣宇，万 丹，卢梦琪，袁 林，汪兴平*

(1.湖北民族大学 生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000；2.风湿性疾病发生与干预湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000)

1817年瑞典科学家Berzelius对使用黄铁矿的矿井铅储罐出现的红色淤泥进行化学分析时，发现了一种与硫的性质相似，且具有金属性质的新元素，将其命名为硒[1].在此后的100多年里，硒一直被认为是有毒物质.1934年美国农业部的报告中指出，高硒植物饲养后的动物会出现明显的中毒现象.直至1957年，Schwarz等[2]在对肝坏死小鼠进行研究时发现与维生素E和胱氨酸相比，硒在预防肝坏死方面效果更加显著，证实了硒具有营养作用.1973年，Rotruck等[3]发现了硒区别于维生素E的作用，是谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)的必要组成部分.同年，世界卫生组织将硒列为人体和动物所必需微量元素.1979年，中国科学家发现克山病的产生与硒的缺乏密切相关[4]，这也是第一次关于硒与疾病的相关研究和报道.1986年，Chambers等[5]对小鼠GSH-Px基因重组体进行鉴定时，发现了酶活性部位的硒半胱氨酸——人类第21种氨基酸，是由TGA所编码的.1988年，我国营养协会将硒元素列为每日必需摄入15种膳食营养素之一，并公布了补硒的参考标准[6].

硒作为人体必需微量元素之一，缺乏时将会导致克山病、大骨节病、肝脏病等40多种疾病.1982年，Salonen等[7]对心血管疾病死亡率极高的地区进行调查时发现，低水平硒会增加冠心病患者的死亡风险，冠心病患者(平均为51.8 μg/L)比正常人(55.3 μg/L)的血硒含量低很多，当血硒低于45 μg/L时，22%的冠心病患者死亡原因来自硒.硒作为谷胱甘肽过氧化物酶的辅助因子参与必需硒蛋白的生物合成，从而在抗氧化保护和氧化还原调节方面发挥显著作用[8]，能够预防心血管疾病、提高自身免疫力、抗肿瘤等.Alehagen[9]对低硒老年人进行为期4 a的硒补充，结果显示，当每日摄入200 μg的硒酵母和辅酶Q10时，心血管死亡率显著降低，心脏功能得到改善.硒的适当摄入可以调节抗氧化基因的表达，如GSH、GPX等，并参与抗氧化防御机制，从而降低氧化损伤[10-11].在对动物进行高硒饲料喂养试验中，发现不论是大鼠还是蛋鸡，其GSH-Px活性与对照组相比均有明显的增强[12-13].不仅如此，硒可以通过调节活性氧(ROS)和超氧化物歧化酶(SOD)的产生来发挥其抗氧化能力.Zhang等[14]发现适当的硒可以通过调节ROS的产生，进而影响小鼠树突状细胞的成熟和抗原呈递，调节树突状细胞的免疫功能.Kaur等[15]对小鼠使用硒后，SOD的活性得到调节，增强了清除自由基的能力，减缓了小鼠因双酚A引起的睾丸损伤.

在补硒的相关用量标准中[16]，膳食中硒的最高安全摄入量为400 μg/d，而人体硒中毒限量是800 μg/d，其营养需求量与毒性剂量非常接近，超过安全剂量就会引发实质性的伤害[17].当血硒浓度高于122 μg/L时，人群继续进行硒的摄入和补充，将会干扰胰岛素信号的传导，从而增加2型糖尿病的风险[18]；以剂量300 μg/d对人体进行为期5 a的硒补充，将会增加10 a后11.7%的死亡率[19].因此，科学补硒显得十分重要.

1 硒的毒性机制

Seko等[20]早期的实验设计验证了氧化应激机制可能是硒毒性的一种机制.该机制主要阐述了亚硒酸盐、硒酸盐、硒蛋氨酸等含硒化合物与谷胱甘肽(GSH)反应易于形成Se2-或SeH-，这些硒化物具有很高的氧化还原特性，与氧气反应生成超氧化物或活性氧，导致生物体内的氧化还原循环、内质网应激反应和DNA链断裂从而使细胞死亡，如图1所示[21-22].体外实验发现[23]，单独的亚硒酸盐不能产生DNA链断裂，仅在加入GSH或在HSe-存在下发生断裂.

图1 硒毒性的氧化应激机制[20]Fig.1 Oxidative stress mechanism of selenium toxicity[20]

正常情况下，硒通过消化道、呼吸、注射等进入体内，然后在十二指肠和盲肠被吸收进入血液，并运输到各种组织和器官被加以利用[24].肝脏是硒代谢和储存的主要器官，大部分含硒蛋白质在此合成，不仅如此硒在肝脏中通过甲基转移酶进行甲基化，经过呼吸和尿液排出体外.而当人体摄入高浓度硒后，硒的甲基化途径受到抑制，机体硒平衡出现破坏，从而引发毒性[25].

此外，一些研究表明，动物硒中毒的原因是由于硒和硫之间的相似性，当人体摄入大量硒后，参与硫代谢的酶会将硒错认，形成硒化物，如硒代蛋氨酸和硒代半胱氨酸，干扰蛋白质表达，对机体造成一定的损害[26].

2 硒的急性毒性

急性毒性是了解新物质安全性的第一步，通过动物的死亡情况，测定半数致死量(LD50)，初步估测毒性作用的靶器官，预测毒性机理，为后续新物质的安全性评价提供相应的理论依据[27].

硒有两种存在形式，无机硒和有机硒.无机硒一般指亚硒酸盐和硒酸盐，最先被作为硒补充剂使用.但无机硒对人体会产生更强毒性，导致其生物活性阈值更低，如表1所示，无机硒属于剧毒物质，其LD50小于50 mg/kg.有机硒主要为硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸、硒氰基乙酸钾等，具有较高的生物活性和生物利用率且毒性较低.与无机硒相比，毒性大小一般为亚硒酸钠>硒酸钠>硒代蛋氨酸[28].现有研究涉及的有机硒LD50最低的是51.91 mg/kg，最高的达到525.21 mg/kg，数值比无机硒大几倍至几十倍，均属于中等毒性，比无机硒毒性降低一级.因此为进一步提高可选择性，降低硒的毒性作用，寻求高效的富硒有机产品成为热点.如利用微生物发酵的特性，将无机硒转变为有机硒，衍生出新的富硒有机产品[29]，如谢玉韬[30]利用嗜热链球菌、酵母菌及混合菌种发酵6个月，获得毒性较低的生物硒.近年来，有研究发现将硒与纳米技术结合起来获得的5～200 nm的纳米硒单质，表现出高效的生物活性[31-32]和较低的毒性[33]，如含量高于97%的100 nm单分散纳米硒[34]的LD50为303.94 mg/kg，是亚硒酸钠的14倍[35]，被认为是一种潜在的优质硒补充剂.但制备手段的不同，也赋予了纳米硒不同的毒性，生物纳米硒与化学纳米硒相比，毒性较小.Mal等[36]以斑马鱼为试验对象，发现牛血清白蛋白稳定的纳米硒(Nano-Sec)半致死浓度(LC50)为0.16 mg/L、而由厌氧颗粒污泥为培养基的生物纳米硒(Nano-Seb)LC50为1.77 mg/L.

表1 不同种类硒的急性毒性Tab.1 Acute toxicity of Selenium of different kinds

3 硒的遗传毒性

遗传性毒性试验主要包括致突变试验、代谢试验，主要目的是更进一步了解被测物的安全性，明确被测物在体内的致畸、致癌可能性，从而对被测物进行筛选.

Kobayashi等[46]让TA98、TA100、TA1535菌株分别在0.05、0.5、5、10、20、50和100 μg/mL的硒酸盐、亚硒酸钠条件下培养48 h，结果显示无论有或没有S9混合物(由大鼠肝脏匀浆制备，用于模拟体内代谢活化系统)，硒酸盐对TA1535菌株显示出低突变性，而亚硒酸钠则无突变性.然而，在其他研究中，亚硒酸盐被证明在鼠伤寒沙门氏菌菌株TA104中具有致突变性[47].Wang等[35]对昆明小鼠连续灌胃5 d亚硒酸钠，剂量分别为10.59、5.29和2.65 mg/kg，结果显示所有剂量均会导致骨髓细胞微核率的增加和精子畸变率的上升.李元新等[48]对亚硒酸钠进行骨髓嗜多染红细胞微核(PCE)试验，剂量分别为0.90、0.45、0.23 mg/kg，结果显示当受试物终浓度为0.90、0.45 mg/kg剂量组的微核率与对照组相比具有显著性差异，结果呈阳性.细胞遗传毒性检测中，亚硒酸钠的细胞遗传毒效应的阈值浓度为6.48×10-7mol/L[49]；0.1 mol/L的亚硒酸钠会使得酿酒酵母菌株SJR751在复制细胞中双链断裂，诱导DNA损伤，在酵母中表现出毒性作用[50].

与无机硒诱导细胞微核率、精子畸变、Ames结果阳性相比，有机硒和纳米硒的结果就大相径庭.Yang等[51]对硒甲基硒代半胱氨酸的Ames试验，在有或没有S9的处理条件下，浓度为0、1.6、8.0、40、200、1 000 μg/板的硒甲基硒代半胱氨酸，对4种菌株TA97、TA98、TA100和TA102均未表现出突变性；在小鼠骨髓微核和精子致畸实验中，剂量为0、1.15、2.31和4.63 mg/kg，结果显示细胞染色无致突变性，精子也未产生诱变.Qin等[52]以昆明小鼠为实验对象，以硒计剂量为22.446、44.574、89.148 μg/kg硒蛋白粉进行的骨髓微核试验，87.21、193.80、387.60 μg/kg剂量进行精子致畸试验，结果显示并没有引起体内微核率的增加及对精子产生明显的诱变.Griffiths等[53]对酵母硒(含硒量为2000 mg/kg)进行Ames试验，结果显示在最高浓度1 000 μg/皿的情况下，也未显示出毒性作用；体外人淋巴细胞染色体畸变试验中，不加S9处理时终浓度为9.77、19.53、39.06、78.13、156.30、312.50 μg/mL，加S9处理时终浓度为9.77、19.53、39.06、78.13、156.30、312.50、625.00、937.50、1 250.00 μg/mL均未引起畸变.谢玉韬等[30]对两种毒性较小的生物硒(LD50分别为525.21、392.55 mg/kg)在小鼠骨髓细胞染色体畸变试验中，分别取用LD50的1/2、1/4、1/8进行灌胃，所有结果均显示阴性.Bhattacharjee[54]对不同形态硒进行小鼠骨髓细胞染色体畸变试验，剂量为2 mg/kg，结果显示，对照组染色体畸变的程度为14.17%，与之相比，无机硒(26.06%)有显著性差异，而有机硒(17.08%)和纳米硒(13.34%)无差异.

硒的遗传毒性已在多种体内外实验中进行了测试，这些结果都表明了化学形式和剂量的重要性.无机硒遗传毒性实验结果呈现出阳性或诱变性，引起细胞毒性及DNA损伤.同浓度下的亚硒酸钠、1,4-亚苯基-双(亚甲基)硒氰酸酯、纳米硒，仅亚硒酸钠对小鼠表现出遗传毒性[54].此外纳米硒的毒性研究深度欠缺，在遗传毒性上，其数据更少，但从现有实验数据来看，与无机硒相比，有机硒和纳米硒则显示无毒.

4 硒的亚急性、亚慢性毒性

亚急性(14～30 d)、亚慢性毒性(90 d)试验的开展是在遗传毒性试验呈阴性后，将不同剂量的被测物经较长时间喂养后，了解被测物的毒性作用性质、靶器官及对动物生长发育的影响，并初步确定最大未观察到有害作用的剂量和致癌的可能性，为慢性毒性和致癌试验提供数据支撑.

人体对硒的最低需求量为17 μg/d，主要是预防缺硒症，即克山病；200 μg/d被证明是预防癌症的有效剂量[55].一项报告称乙型肝炎表面抗原(HBsAg)男性携带者服用亚硒酸钠(0.5 mg/a)2 a后患肝癌的风险大大降低[56]，另一项研究报告的有机硒[57](含200 μg硒酵母)对HBsAg携带者补充4 a后，发现补硒组肝癌发病率明显低于对照组.硒补充剂作为预防肝癌的药物得到了强有力的支持.

硒对人体的最高安全限量为400 μg/d，以人70 kg计相当于5.7 μg/kg，根据体表面积等效剂量比值，大鼠和小鼠与人的比例为6.3和9.1倍，即35.91、51.87 μg/kg.如表2所示，在此剂量内的实验大、小鼠均未表现出明显的中毒迹象.而高于此安全剂量的复方富硒酵母破壁灵芝孢子粉[58]对大鼠30 d喂养结果显示并未表现出中毒迹象，与对照组相比实验组大鼠体重、血生化指标、脏器指数无显著性差异；硒甲基硒代半胱氨酸[59]的90 d经口毒性试验结果显示最大未观察到的有害剂量(NOAEL)为450 μg/kg；硒甲基硒代半胱氨酸(217、303.8、390.6 μg/kg)[51]中各剂量组的摄食量、血生化与对照组相比不具有毒理学意义，但其肝脏重量呈剂量依赖性的增加.肝脏是硒中毒的主要靶器官.一项亚急性毒性研究发现，硒甲基硒代半胱氨酸对大鼠和狗进行28 d喂养后发现肝脏肿大和肝细胞变性，肝脏重量与剂量呈现正相关[60].因此，在亚慢性毒性试验中这几种新型营养硒补充剂具有更高的安全性，但当此剂量被应用于实现营养价值时，则还需要对其进行评估，以确定是否对人体健康产生危害.

表2 不同种类硒的亚急性、亚慢性毒性Tab.2 Subacute and subchronic toxicity of Selenium of different kinds

如表2所示，过量摄取硒的动物表现出明显的中毒现象，首当其冲的是生长发育情况出现异常.尹小平[61]令黑鸡每日硒摄入量达到12 mg/kg，28 d后，所有黑鸡出现不同程度的食欲降低、精神萎靡、生长缓慢等异常现象；龋齿类动物在摄入高剂量硒后也会出现食欲不振、体重下降的情况[62].其次表现在血液参数的异常，鄢鹏飞等[63]发现富硒油菜粉(LD50为11.75 g/kg)对大鼠血生化有影响，结果显示雄性大鼠的ALT参数有显著性差异；Shakibaie[38]对雄性NMRI小鼠进行14 d经口毒试验，结果显示20 mg/kg组与对照组相比体重出现下降，ALT、AST和ALP等肝酶活性，血红蛋白、甘油三酯、白细胞计数、红细胞计数等血液参数有显著性差异.再次，从脏器指数和病理切片中更易观察到硒中毒的靶器官，胡滨等[37]对Wistar大鼠连续30 d经口灌胃亚硒酸钠，结果显示，与对照组相比，所有剂量组大鼠的心脏、肝脏、肾脏、肺脏系数增加，心肌细胞和肝细胞增大且伴有颗粒性病变.最后，过高剂量的硒会引起死亡，张帆[64]对小鼠灌胃124.03 mg/kg的酵母硒，出现明显的中毒特征，且2只小鼠死亡；王光等[62]探究的纳米硒在260 mg/kg时，小鼠死亡率高达16.7%.

5 结语

综上所述，硒的毒性研究取得了显著成果.急性毒性试验得出，硒的毒性取决于其化学形态，通常无机硒比有机硒毒性更强，有机硒比纳米硒毒性更强[54].张帆[64]研究的5种酵母硒毒性，即使是毒性最强的一号酵母硒(LD50为33.33 mg/kg)也低于同组测得的亚硒酸钠(LD50为17.86 mg/kg)；Zhang等[40]测得的纳米硒(LD50为113 mg/kg)对小鼠的急性毒性比亚硒酸钠(LD50为15.7 mg/kg)低7倍；Wang等[44]测得的纳米硒(LD50为92.1 mg/kg)对小鼠中的急性毒性比硒代蛋氨酸(LD50为25.6 mg/kg)低3.5倍.但也有学者研究发现[67]，由酿酒酵母生产的硒氨基酸(硒代半胱氨酸、硒代甲硫氨酸)毒性要弱于100～200 nm的元素纳米硒.

现有研究中无机硒具有遗传毒性，无论是体内还是体外实验，均发现阳性结果，但因其体内给药最低有毒剂量是人体最高安全剂量的51倍，实验数据有限.有机硒未发现遗传毒性.由于有机硒的来源和种类多样，每种类型的研究数据更显不足.

在硒的亚急性及90 d毒性研究中所见到的毒性，均可归因于所给剂量过大，其中最低给药剂量268 μg/kg的亚硒酸钠[37]，最高260 mg/kg的纳米硒[62]，分别是人体最高安全限量(400 μg/d)的7.46和5 012倍.因此现有实验结果均间接说明人体推荐补充剂量(50～250 μg/d)是合理安全的.

此外有机硒的分子形态尚不清晰，如鄢鹏飞等[63]研究的富硒油菜粉为硒蛋白，卢昊等[42]研究的有机硒，其主要成分为硒氰基乙酸钾，张帆[64]认为酵母硒是含有硒氨基酸、硒多糖、硒蛋白的一种混合物，Lu等[68]认为富硒酵母和食品中主要的化学形式是硒代蛋氨酸，Griffiths等[53]研究的酵母硒中98%为硒代蛋氨酸.但这类人工转化富硒品中是否还存在其他形态的硒，其含硒量、不同形态硒之间的相互影响还未可知.

纳米硒来源于硒氧阴离子通过还原剂、生物发酵、物理辐射等手段制备而成，其毒性要比无机硒低得多，且硒的纳米颗粒具有很多特性，如高度吸收性和高生物活性[69-70]，因此被认为是一种新型的硒补充剂.但纳米硒因其不稳定的形态，需要借助合适的纳米载体保证其稳定性或通过生物合成稳定的纳米硒[71]，且要考虑其广泛适用性，须使用非病原微生物，因此开发合成和控制释放硒纳米颗粒技术仍在不断探索.

未来的研究中需要进一步优化补硒的种类，加大不同有机硒和纳米硒的研究深度，进一步明确硒在生物体中的分子形态、硒的营养机制，为硒补充剂的开发提供强力的理论基础，为科学补硒提供理论保障，减少潜在的风险.