许忠伟 刘春月 石佳悦 邵霞 宋宇

（辽东学院，辽宁 丹东 118003；第一作者：2020358115@qq.com；*通讯作者：763869365@qq.cm）

土壤微生物是自然系统和管理生态系统的关键组成部分[1]。植物可依靠根系和土壤微生物之间的相互作用来促进其营养吸收。根际是根的表面和贴近根的周围的土层，受植物根系分泌物、脱落物和植物残体等影响，是植物、土壤和微生物的连接纽带，内含不计其数的微生物，是地球上最活跃的界面之一。在农业生态系统中，根际微生物群对作物生长、营养和健康有着深刻的影响[2]。随着高通量测序技术的发展，常规种植的水稻根际微生物群落得到了一定研究[3]。人们通过在稻田中引入鱼、小龙虾、鳖等生物进行稻田复合种养，不仅改善了农田环境、满足了人们对绿色安全稻米的需求，而且还有助于解决长期大量使用化肥农药所造成的环境污染、土壤肥力下降和药物残留等一系列问题[4-5]。目前对共作稻田的研究主要集中在对稻田水体环境、病虫害防治、水稻产量、某个特定生长时期根际微生物群落结构的影响上以及不同稻田共作模式对表层土壤细菌群落结构的影响及多样性分析等方面[6-12]，对稻蟹共作田根际细菌群落在水稻不同生育期的变化规律知之甚少。为此，作者设计了本试验，以期为水稻不同生育期专用菌剂开发奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验方法

以粳稻品种越光为试验材料，试验地点设在辽宁省东港市北井子镇盖家坝农场，试验稻田面积700 m2。水稻于2020 年5 月10 日进行移栽，栽插规格30 cm×15 cm。于3 月份和7 月份施用日照益康有机农业科技发展有限公司生产的海藻生物有机肥，用量均为1.35 kg/hm2。4 月末投放河蟹苗，投放量为 0.5 kg/hm2，10 月末收蟹。

1.2 测定指标及方法

1.2.1 土壤样品采集与处理

分别在水稻分蘖期（6 月 29 日）、拔节期（7 月 31日）、抽穗期（9 月 2 日）和成熟期（10 月 15 日）在稻田上随机选取5个点，采用破坏性取样法将水稻整株挖出，勿伤害根系，抖落大块土壤后用无菌刷刷取根际区域约5 mm 紧密粘附在根表面的土壤，每5 株为1个重复，每个时期3 次重复。混合后的样品分成两份，一份装入密封袋，带回风干处理，用于理化指标分析；一份装入50 mL 离心管中，于-80℃温度下冷冻保存，用于微生物多样性分析。稻蟹共作田的分蘖期、拔节期、抽穗 期 和成熟 期 分别 用 HXTFN、HXTBJ、HXTCHS 和HXTCS 表示。

1.2.2 土壤理化因子

土壤pH 值采用酸度计法测定；有机质测定采用重铬酸钾氧化-分光光度法；速效钾测定采用氯化钙浸提-火焰光度计法；速效磷测定采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法；全氮测定采用凯氏定氮法[13]。

1.2.3 土壤样品总DNA 提取、PCR 扩增及高通量测序

利用FastDNA®Spin Kit for Soil 试剂盒进行基因组DNA 提取，扩增引物为338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG；806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。PCR扩增程序为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃45 s，27个循环；72 ℃ 10 min；PCR 产物经鉴定、纯化、定量和Miseq 文库构建后，利用Illumina 公司的Miseq PE300 平台进行测序。

1.3 数据处理

利用Trimmomatic[14]软件对MiSeq 高通量测序得到的Raw Data 的双端序列数据进行去杂，使用 FLASH（1.2.11）[15]软件进行拼接。再通过 QIIME（1.9.1）[16]软件进行质控和usearch[17]软件去除嵌合体序列即得到优质序列。利用Uparse（version 7.1）软件按照97%相似性对非重复序列（不含单序列）进行OTU 聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU 的代表序列。采用RDP classifier（version 2.1.1）贝叶斯算法对97%相似水平的OTU 代表序列进行分类学分析，并分别在各个分类学水平上对比Silva（Release132 数据库），统计各样本的群落物种组成。利用R 软件生成组间OTU 维恩图，利用 mothur（1.30.2）软件计算 α 多样性指数[18-20]，利用SPSS 26.0 软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同生育期水稻根际土壤理化因子

如表1 所示，稻蟹共作田在不同生长时期根际土壤的理化因子都有所变化，成熟期的pH 值最高，与拔节期差异显著。分蘖期和拔节期速效磷的含量与抽穗期和成熟期差异显著。速效钾含量随水稻的生长发育逐渐降低，有机质和全氮含量都是抽穗期最高且与成熟期差异显著。

表1 稻蟹共作田不同生育期水稻根际土壤理化因子

2.2 不同生育期根际土壤细菌群落丰富度和α 多样性指数

从表2 可以看出，稻蟹共作田的4个生育期的覆盖度均超过0.960，接近于1，说明高通量测序到达一定深度，可以说明结果的准确性。稻蟹共作田的4个生育期12个样本共获得444 882个有效序列，样本的有效序列在分蘖、拔节、抽穗和成熟期分别读取了28 311 ±3 377、40 166±6 952、44 800±8 099 和 35 017±10 099。获得6 637个OTU，其中，抽穗期获得的有效序列数和OTU 数均超过另外 3个时期。Chao1 和 Shannon 指数均可作为α 多样性指数的度量指标，Chao1 指数可用来计算菌群丰度，其值越高，代表菌群的丰度值越大，菌群的物种总数越多；Shannon 指数是计算菌群多样性的指数，其值越大，说明群落多样性越高。从表2 可以看出，河蟹稻田4个生育期的Chao1 指数表现为抽穗期＞拔节期＞成熟期＞分蘗期，Shannon 指数4个时期差别不大，说明随着水稻的生长发育，根际微生物的物种总数会发生变化但菌群的多样性变化不明显。

表2 稻蟹共作田不同生育期根际土壤细菌群落丰富度和α 多样性指数

2.3 不同生育时期根际土壤细菌群落比较

图1 为稻蟹共作田不同生育期PCA 分析图。PCA分析即为主成分分析，可通过样本间距离的远近来说明细菌群落的相似性或差异性。PC1 轴和PC2 轴对结果的解释度分别为38.33%和19.52%，从图1 可以看出，拔节期和抽穗期距离较近，说明细菌群落相似性较高，它们和分蘗期及成熟期以及分蘖期和成熟期之间都有一定距离，说明随着水稻的生长发育，细菌群落都在发生变化且有一定差异性。从图2 可以看出，分蘗期、拔节期、抽穗期和成熟期的OTU 数分别为4 690、5 056、5 139 和 5 048。独有的 OTU 数分别为 273、294、264 和 328个。4个时期共有的 OTU 数是 3 122个。随着水稻的生长发育，OTU 数会增加，物种数量会增加，到成熟期OTU 数虽有所下降，但特有的OTU 数即特有的物种数最多。

图1 不同生育期PCA 分析图

图2 不同生育期根际土壤细菌群落OTU 韦恩图

2.4 不同生育期根际土壤细菌群落结构分析

如图3 所示，基于高通量测序，所有样品中绿弯菌门（Chloroflexi）、放线菌门(Actinobacteriota)、变形菌门（Proteobacteria）和酸杆菌门（Acidobacteriota）所占比例较大，分别为 18.96%～28.44%、13.28%～22.90%、12.35%～19.52%和11.43%～14.20%，是稻蟹共作田根际土壤的主要菌群。此外，样品中还检测到拟杆菌门（Bacteroidota）、脱硫杆菌门（Desulfobacterota）、厚壁菌门（Firmicutes）、硝化螺旋菌门（Nitrospirota）、Myxococcota、芽单胞菌门（Gemmatimonadota）、MBNT15、疣微菌门（Verrucomicrobiota）和髌骨菌门（Patescibacteria）等。绿弯菌门的相对丰度随着水稻的生长发育呈现先升高后下降的趋势，分蘖期最低，抽穗期最高；放线菌门则呈现逐步下降的趋势，分蘖期最高而成熟期最低；变形菌门是逐渐下降又升高的态势，抽穗期最低而成熟期最高；酸杆菌门则呈现先升高又下降的趋势，分蘖期最低而拔节期最高；脱硫杆菌门的相对丰度呈现先下降再逐步升高的趋势，拔节期最低而成熟期最高；芽单胞菌门的相对丰度在分蘖期最高而成熟期最低；髌骨菌门的相对丰度则在分蘖期最低而成熟期最高。如图4 所示，样品中检测到的优势菌属（相对丰度＞1%）有31个。在所有菌属中norank_f_norank_0_norank_c_KD4-96 的相对丰度最高，其隶属于绿弯菌门KD4-96 纲，在水稻4个生育时期中，其抽穗期相对丰度最高而成熟期最低。norank_f_norank_0_SBR1031 隶属于绿弯菌门厌氧绳菌纲，分蘖期的相对丰度最低而抽穗期最高。norank_f_Bacteroidetes_VadinHA17 隶属于拟杆菌门拟杆菌纲，分蘖期的相对丰度最低而成熟期最高。基于样品中群落丰度数据，运用Kruskal-Wallis 秩和检验方法检测不同样本微生物群落中表现出的丰度差异的物种，结果显示，基于细菌群落门水平上，绿弯菌门（Chloroflexi）、放线菌门 (Actinobacteriota)、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidota）、脱硫杆菌门（Desulfobacterota）、芽单胞菌门（Gemmatimonadota）和髌骨菌门（Patescibacteria）在稻蟹共作田4个生育期内的丰度差异显著（图5）。在优势菌属中，norank_f_norank_0_norank_c_KD4 -96、norank_f_norank_0_SBR1031、norank_f_Bacteroidetes_VadinHA17 等3个菌属的丰度差异显著（图 6）。

图3 不同生育期根际土壤门水平细菌群落组成

图4 不同生育期根际土壤属水平细菌群落组成

图5 细菌群落门水平Kruskal-Wallis 秩和检验图

图6 细菌群落属水平Kruskal-Wallis 秩和检验图

2.5 不同生育期根际土壤PICRUSt 功能预测

针对KEGG pathway, 运用PICRUSt 软件获得稻蟹共作田不同生育期根际土壤的3个水平信息及其丰度，Pathway level 1 有 7 条代谢通路，Pathway level 2 有46 条代谢通路，Pathway level 3 有371 条代谢通路。在稻蟹共作田的不同生育期细菌群落的代谢通路都相似，但代谢通路的丰度值不同。其中有269 条代谢通路的丰度值是抽穗期高于其他3个时期。有50 条代谢通路存在显著差异（图7），尤其在氨基酸生物合成（Biosynthesis of amino acids）、 碳 代 谢（Carbon metabolism）、核糖体 （Ribosome）、ABC 转运器（ABC transporters）、嘌呤代谢（Purine metabolism）、群体感应（Quorum sensing）等方面差异更为显著，说明抽穗期具有较强的代谢能力。

图7 代谢通路热图

3 讨论与结论

本研究利用Illumina MiSeq 高通量测序技术通过对16SrRNA 基因的V3～V4 高变区的测序分析，成功获得了稻蟹共作田4个生育期根际土壤细菌群落较全面的菌群信息。样本共得到444 882个有效序列，6 637个OTUs，测序读长在401～440 bp 之间，平均测序长度在 415 bp 左右。可分为 54个门，171个纲，381个目，600个科，1 028个属，2 162个种。其中，分蘗期的 OTU数最少，为4 690个，分别比拔节期、抽穗期和成熟期减少7.80%、9.57%和7.63%。Venn 图表明稻蟹共作田4个生育期根际土壤细菌群落之间共有的OTU 数是3 122个，分蘖和拔节期共有的OTU 数是3 828个，分蘖期和抽穗期共有的OTU 数是3 901个，分蘖期和成熟期共有的OTU 数是3 717个，拔节期和抽穗期共有的OTU 数是4 121个，抽穗期和成熟期共有的OTU 数是4 021个，说明抽穗期和拔节期共有的细菌类群最多。α多样性分析表明在稻蟹共作田的4个生育期的Shannon 指数差异不明显，抽穗期的Chao1 指数高于其他3个时期，说明抽穗期的细菌物种总数最多而4个时期种群的丰富度差异不大。PCA 分析表明，拔节期和抽穗期细菌群落相似度高，但这2个时期和其余2个时期的细菌群落都有一定差异。

研究表明，植物根际中存在的大量微生物是参与根际微域活动的主要成员[21]。它们和植物相互作用，可调控土壤微生物的群落结构和丰度的变化[22]。稻蟹共作田不同生育期的土壤根际细菌优势门（相对丰度＞10%）、优势属（相对丰度＞1%）基本相同。土壤细菌优势门（相对丰度＞10%）是绿弯菌门（Chloroflexi）、放线菌门（Actinobacteriota）、变形菌门（Proteobacteria）和酸杆菌门（Acidobacteriota），优势菌属（相对丰度＞1%）有 31个。有研究证实，稻田中含氮量提升后可使绿弯菌门的丰度上升[23]，稻蟹共作田4个生长时期水稻根际土壤的全氮量是抽穗期最高，绿弯菌门的相对丰度在抽穗期也最高。吴晶[24]研究表明，放线菌门与稻田中速效钾含量正相关。本研究中，水稻根际土壤中速效钾的含量随着水稻的生长发育逐渐下降，放线菌门的相对丰度也呈现相同的趋势，分蘖期丰度最高、成熟期最低。王宁等[25]研究证实，变形菌门与pH 值正相关，成熟期的pH 最高，变形菌门的相对丰度也是在成熟期最高。研究证实，酸杆菌门与pH 值负相关[26]，拔节期的pH 值最低而酸杆菌门在拔节期的相对丰度最高。

土壤微生物通过参与土壤有机质分解和矿化等过程来影响土壤养分循环，并调节土壤的功能[27]。利用PICRUSt 方法对菌群代谢功能预测, 稻蟹共作田不同生育期在3个代谢水平通路上都是相似的，有50 条代谢通路存在显著差异，269 条代谢通路的丰度值是抽穗期高于其他3个时期。高通量测序结果显示，抽穗期获得的有效序列数、OTU 数和Chao1 指数在4个生育时期中最多，说明该时期的物种总数最多，而且群落门水平的柱形图显示，绿弯菌门在抽穗期的丰度最高，研究已证实绿弯菌的营养方式极为多样，可涵盖已知的所有类型。化能异养是绿弯菌门微生物的主要营养方式，除此之外还包括化能自养、光能自养、光能异养及混合营养型。同一物种可随外界条件的改变切换所需要的不同营养模式，因此使得绿弯菌门可以驱动自身各种代谢与外界物质交换来获取和利用能源、碳源等来参与了C、N、S 等一系列重要生源元素的生物地球化学循环过程[28]。所以抽穗期的代谢功能最强。

稻蟹共作田不同生育期水稻根际土壤细菌群落结构和功能分析结果表明，抽穗期的细菌物种数目最多且代谢功能最强。