周立涛 陶善东 史文婷 邓媛 朱家斌

(南京医科大学附属淮安第一医院血液科，江苏 淮安 223300)

白血病是一种侵袭性血液恶性肿瘤，其特征是未成熟髓样细胞的异常增殖和分化〔1〕。尽管治疗方法不断增加，但大多数患者仍会复发并在缓解后死亡，预后仍然不理想〔2〕。探索新的生物标志物用于白血病的诊断、预后和治疗靶标十分必要，以便制定更有效的监测和治疗方案。近年来，非编码(nc)RNA，包括长链(l)ncRNA和微小RNA(miR)，因其在白血病发病机制中的关键作用而受到越来越多的关注〔3〕。lncRNA是一组进化保守的ncRNA，长于200个核苷酸，可在表观遗传、转录和转录后水平上调节基因表达〔4〕。lncRNA常在人类恶性肿瘤中异常表达，并参与广泛的生物学过程，包括细胞增殖、凋亡、转移和癌变〔5〕。既往研究表明，lncRNA ENST00000415964在急性髓细胞性白血病患者中表达下调〔6〕，但其在白血病中的生物学功能与机制尚不清楚。miR是另一类短的单链ncRNA，长度约为20个核苷酸，miR通过与靶mRNA的3′非编码区(UTR)结合，导致mRNA的降解或翻译抑制，在基因表达的调控中起着至关重要的作用〔7〕。在这些miR中，miR-214已被证明在白血病患者中表达上调，抑制其表达有助于增强耐药的慢性淋巴细胞白血病细胞对氟达拉滨的敏感性〔8〕，表明miR-214可能成为白血病潜在的预后生物标志物。资料显示，lncRNA可充当竞争性内源(ce)RNA调控miR的表达，随后在转录后水平上调控miR靶基因的表达，从而影响癌症进展〔9〕。但ENST00000415964是否可作为miR-214海绵调节白血病的发生发展过程仍然未知。DKK3是一种抑癌基因，DKK3基因mRNA的相对表达在急性髓性白血病患者中显著下调，其甲基化水平是患者预后的重要影响因素〔10〕。本研究探讨ENST00000415964调控在miR-214/DKK3对急性白血病细胞增殖、周期和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1临床标本 在2015～2018年南京医科大学附属淮安第一医院血液科的32例急性白血病患者和17例健康者(对照组)中获取临床标本。本研究获得患者及其家属知情同意，并通过医院伦理委员会批准。急性白血病患者是根据世界卫生组织(WHO)的造血和淋巴组织肿瘤分类(2016年)〔11〕进行初步诊断。使用Ficoll溶液进行单核细胞的分离，用于实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测。

1.2细胞与主要试剂 白血病细胞K562购自美国典型培养物保藏中心，RPMI1640培养基购自美国Gibco，Lipofectamine2000试剂购自美国Invitrogen，PrimeScriptTMRT试剂盒、Premix Ex Taq试剂盒购自日本TaKaRa，细胞计数试剂盒(CCK)-8购自日本Dojindo，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、P21、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3、DKK3抗体和辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗购自英国Abcam，聚偏氟乙烯(PVDF)膜购自美国Millipore，碘化丙啶(PI)细胞周期分析试剂盒、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)细胞凋亡检测试剂盒购自上海Beyotime。

1.3细胞培养、转染与分组 细胞K562在含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的RPMI1640培养基中，在37℃、5% CO2、饱和湿润条件下孵育。pcDNA3.1-ENST00000415964及其阴性对照pcDNA3.1、miR-214及其阴性对照miR-NC、anti-miR-214及其阴性对照anti-miR-NC、si-DKK3及其阴性对照si-NC均获自上海GenePharma。将对数生长期的细胞K562分为pcDNA3.1组(转染pcDNA3.1)，pcDNA3.1-ENST00000415964组(转染pcDNA3.1-ENST00000415964)，pcDNA3.1-ENST0-0000415964+miR-NC组(共转染pcDNA3.1-ENST-00000415964和miR-NC)，pcDNA3.1-ENST00000-415964+miR-214组(共转染pcDNA3.1-ENST00-000415964和miR-214)，pcDNA3.1-ENST00000415-964+si-NC组(共转染pcDNA3.1-ENST00000415964和si-NC)，pcDNA3.1-ENST00000415964+si-DKK3组(共转染pcDNA3.1-ENST00000415964和si-DKK3)，miR-NC组(转染miR-NC)，miR-214组(转染miR-214)，anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC)，anti-miR-214组(转染anti-miR-214)。细胞转染时，将细胞K562接种于6孔板，每孔1×105个细胞，细胞汇合至70%密度时，严格按照Lipofectamine2000试剂说明书指示，按照上述分组进行转染，收集转染48 h后的细胞进行后续实验。

1.4qRT-PCR检测ENST00000415964、miR-214表达 使用TRIZOL试剂提取急性白血病患者样品和转染后细胞K562的总RNA，采用PrimeScriptTMRT试剂盒进行逆转录，以得到的cDNA为模板，利用Premix Ex Taq试剂盒于ABI 7500系统中进行qRT-PCR。引物序列如下：ENST00000415964正向5′-CTCCAAGCATGACACAGACA-3′，反向5′-CCTTTAAGTCCCCAATTCCA-3′；GAPDH正向5′-CGCTCTC-TGCTCCTCCTGTTC-3′，反向5′-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3′；miR-214正向5′-AGCATAATACAGCAGGCACAGAC-3′，反向5′-AAAGGTTGTTCTCCACTCTCTCAC-3′；U6正向5′-ATTGGAACG ATACAGAGAAGATT-3′，反向5′-GGAACGCTTCAC-GAATTTG-3′。ENST00000415964的表达标准化为GAPDH，miR-214的表达标准化为U6，并通过2-△△Ct法进行计算。

1.5CCK-8法分析细胞增殖 将转染后的细胞K562以5×103个细胞/孔的密度接种于96孔板，48 h加入10 μl CCK-8试剂，继续孵育，2 h后于酶标仪测定450 nm处的细胞吸光度，计算细胞存活率(%)。

1.6流式细胞术评估细胞周期和凋亡 PI细胞周期分析试剂盒用于评估K562细胞的周期。Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒用于检测K562细胞的凋亡。将转染后的细胞K562以1×105个细胞/孔的密度接种于24孔板，培养48 h后，用冰冷的磷酸盐缓冲液冲洗并离心以除去上清液。根据试剂盒说明书的步骤，通过FACScan流式细胞仪确定细胞的周期和凋亡。

1.7Western印迹测定P21、Caspase-3、DKK3蛋白表达 向细胞K562中加入RIPA裂解液以提取蛋白，按照二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒的步骤估算蛋白浓度。通过10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白样品，并转移至PVDF膜。PVDF膜经5%脱脂牛奶封闭2 h，与稀释度为1∶1 000的P21、Caspase-3、DKK3一抗孵育过夜，与HRP标记的二抗孵育2 h，然后使用增强的化学液显影曝光。GAPDH被用作对照，以分析P21、Caspase-3、DKK3蛋白表达。

1.8生物信息学预测和双荧光素酶实验验证ENST00000415964对miR-214、miR-214对DKK3的靶向调控 在线预测工具Starbase(http://starbase.sysu.edu.cn/)预测发现，ENST00000415964的3′UTR含有miR-214的互补序列，DKK3的3′UTR含有miR-214的互补序列。分别合成包含miR-214互补位点的ENST00000415964或DKK3的3′UTR野生型(WT)结合序列，并将其克隆到pmirGLO荧光素酶载体，以生成WT-ENST00000415964或WT-DKK3。构建相应的突变型(MUT)序列，并将其克隆到相同的载体中，即MUT-ENST00000-415964或MUT-DKK3。转染前，将细胞K562接种于24孔板，使用Lipofectamine 2000试剂分别将WT-ENST00000415964或MUT-ENST00000415964与miR-NC或miR-214共转染，WT-DKK3或MUT-DKK3与miR-NC或miR-214共转染。转染后48 h收集细胞，并使用双荧光素酶报告基因测定系统测定荧光素酶活性。

1.9统计学分析 采用SPSS22.0软件进行t检验、单因素方差分析、组间多重比较采用SNK-q检验。

2 结 果

2.1ENST00000415964在急性白血病患者和对照组骨髓细胞中的表达 急性白血病患者ENST00000415964表达量(0.29±0.03)明显少于对照组(1.00±0.05；t=62.241，P=0.000)。

2.2过表达ENST00000415964对细胞K562增殖的影响 与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-ENST00000415964组细胞K562的G0期细胞百分比显著增加，S期显著减少，细胞存活率显著降低，P21蛋白表达量显著提高(P<0.001)，而G1期细胞百分比无显著变化(P>0.05)。见表1，图1。

表1 过表达ENST00000415964对细胞K562增殖的影响

图1 P21蛋白表达

2.3过表达ENST00000415964对细胞K562凋亡的影响 与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1ENST-00000415964组细胞K562中ENST0-0000415964表达量、细胞的凋亡率及Caspase-3蛋白水平显著提高(P<0.001)。见表2、图2。

表2 过表达ENST00000415964对细胞K562凋亡的影响

1，2：pcDNA3.1组，pcDNA3.1-ENST00000415964组

2.4ENST00000415964靶向调控miR-214 生物信息学预测结果显示，miR-214是ENST000-00415964的候选靶基因。见图3。与miR-NC和WT-ENST00000415964共转染(1.00±0.05)相比，miR-214和WT-ENST00000415964共转染明显降低细胞K562的荧光素酶相对活性(0.36±0.03；t=32.928，P=0.000)；miR-NC或miR-214和MUT-ENST00000415964共转染后，细胞K562的荧光素酶相对活性无显著变化〔(0.99±0.06)vs(0.97±0.05)；t=0.768，P=0.454〕。与pcDNA3.1组(1.01±0.05)相比，pcDNA3.1-ENST00000415964组明显减少细胞K562内miR-214表达量(0.23±0.03；t=40.131,P=0.000)。

2.5过表达miR-214能减轻ENST00000415964对细胞K562增殖、凋亡的影响 与pcDNA3.1-ENST00000415964+miR-NC组相比，pcDNA3.1-ENST00000415964+miR-214组细胞K562的G0期细胞百分比明显减少，S期明显增加(P<0.001)，而G1期细胞百分比无明显变化(P>0.05)，细胞存活率明显提高，凋亡率明显降低(P<0.001)，miR-214表达量明显增加，P21和Caspase-3蛋白表达量明显减少(P<0.001)。见表3、图4。

图3 ENST00000415964靶向miR-214

表3 过表达miR-214能减轻ENST00000415964对细胞K562增殖、凋亡及相关蛋白的影响

1，2：pcDNA3.1-ENST00000415964+miR-NC组，pcDNA3.1-ENST00000415964+miR-214组

2.6抑制DKK3能减轻ENST00000415964对细胞K562增殖、凋亡的影响 与pcDNA3.1-ENST00000-415964+si-NC组相比，pcDNA3.1-ENST00000415964+si-DKK3组细胞K562的G0期细胞百分比明显减少，S期明显增加(P<0.001)，而G1期无明显变化(P>0.05)，细胞存活率明显提高，凋亡率明显降低(P<0.001)，DKK3、P21和Caspase-3蛋白表达量明显减少(P<0.001)。见图5、表4、表5。

1，2：pcDNA3.1-ENST00000415964+si-NC组，pcDNA3.1-ENST00000415964+si-DKK3组

表4 抑制DKK3能减轻ENST00000415964对细胞K562增殖、凋亡的影响

表5 P21、Caspase-3、DKK3蛋白的表达

2.7miR-214靶向调控DKK3 生物信息学预测结果显示，DKK3的3′UTR含有miR-214的互补序列。见图6。与miR-NC和WT-DKK3共转染(0.96±0.06)相比，miR-214和WT-DKK3共转染明显减少细胞K562的荧光素酶活性(0.20±0.03；t=33.988，P=0.000)；miR-NC或miR-214和MUT-DKK3共转染细胞K562的荧光素酶活性无显著变化〔(0.97±0.06)vs(0.98±0.06)；t=0.354，P=0.728〕。与miR-NC组(0.28±0.03)相比，miR-214组明显减少细胞K562的DKK3蛋白表达量(0.09±0.01；P<0.05)，与anti-miR-NC组(0.30±0.03)相比，anti-miR-214组显著提高DKK3蛋白水平(0.63±0.04；P<0.05)。见图7。

图6 DKK3的3′UTR含有miR-214的互补序列

1～4:miR-NC组,miR-214组，anti-miR-NC组，anti-miR-214组图7 DKK3蛋白的表达

3 讨 论

随着高通量分析的发展，已经鉴定出越来越多与肿瘤相关的ncRNA，特别是lncRNA、miR和mRNA已被证明通过各种生物学过程发挥着多种功能，它们的失调可能触发和(或)促进病理改变〔12〕。本研究证明了lncRNA ENST00000415964在白血病患者中的表达显著下调，而ENST00000415964的过表达可抑制白血病细胞增殖，阻滞细胞周期，同时诱导其凋亡。ENST00000415964充当ceRNA，通过竞争性的结合miR-214来调控DKK3的表达，影响白血病细胞的增殖、周期和凋亡过程。

据报道，lncRNA在癌细胞的恶性表型中起重要作用，lncRNA在肿瘤细胞中异常表达，其失调会产生致癌或肿瘤抑制功能，与包括白血病在内的疾病密切相关〔13，14〕。如lncRNA HAND2-AS1在慢性粒细胞白血病中被下调，通过上调miR-1275表达，抑制白血病细胞的增殖并促进其凋亡〔15〕。SNHG16在急性淋巴细胞白血病中被上调，其下调通过对hsa-miR-124-3p的相互作用，可能在白血病中发挥肿瘤抑制作用〔16〕。Cao等〔17〕分析了儿童急性髓细胞性白血病患者骨髓样本中lncRNA的表达，发现与正常对照相比，儿童急性髓细胞性白血病中ENST00000415964下调了10倍以上。然而，对于ENST00000415964在白血病细胞增殖、周期和凋亡中作用知之甚少。本研究中32例急性白血病患者骨髓样品中的ENST00000415964被下调，与Cao等〔17〕研究一致。本研究结果表明ENST00000415964可抑制白血病细胞的增殖，阻滞细胞周期，并且诱导细胞凋亡，显示出一定的抗癌活性。

lncRNA通常通过充当miR的海绵，来抵消miR介导的下游靶标mRNA或信号通路的阻遏作用，从而发挥其生物学作用〔18〕。miR已被证明与白血病的发生和发展有关，可作为诊断和预后的新生物标志物，并成为白血病的潜在治疗靶标〔19〕。据报道，miR-214在白血病患者中表达上调〔8〕，转染miR-214抑制剂显著上调第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白(PTEN)蛋白的表达并诱导慢性淋巴细胞白血病细胞的凋亡〔20〕。miR-214通过靶向ABCB1基因表达，调节慢性髓性白血病患者的甲磺酸伊马替尼耐药〔21〕。本研究发现miR-214与ENST00000415964存在靶向结合位点，提示ENST00000415964负调控miR-214的表达。功能实验分析说明，lncRNA ENST00000415964通过靶向miR-214来调节白血病细胞的增殖、周期和凋亡。

miRNA参与细胞分化、增殖和凋亡，从而影响肿瘤的发生和发展〔22〕。miRNA通过结合靶mRNA的3′UTR，在ceRNA网络中起着重要作用。生物信息学软件分析表明，DKK3的3′UTR部分核苷酸序列可与miR-214形成互补配对。进一步使用荧光素酶报告试验，证明DKK3是miR-214的潜在靶基因。据报道，DKK3位于染色体11p5.1，在多种肿瘤中表达下调，DKK3高甲基化导致其表达下调〔23〕。并且，在急性白血病患者中，DKK3表现出高甲基化，这可能是白血病重要的发病机制〔24〕。本研究结果表明，通过调节miR-214/DKK3途径，ENST00000415964可以抑制白血病的发生发展。

综上，lncRNA ENST00000415964在急性白血病患者中表达下调，具有抑制白血病细胞增殖、阻滞细胞周期和促进细胞凋亡的作用，并且其机制与靶向miR-214调控DKK3的表达有关。