庞 峰 (1.贵州大学 动物科学学院,贵州 贵阳 550025；2.贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室，贵州 贵阳 550025)

羊口疮 (orf) 又称为羊传染性脓疱 (contagious ecthyma)，是由羊口疮病毒 (orf virus,ORFV) 引起的一种急性、高度接触性人畜共患病。该病主要感染绵羊、山羊等小反刍动物，人也可被感染[1-2]。我国多个省份均报道过该病的发生和流行，该病的暴发和流行严重危害我国养羊业的发展和人类健康[3-5]。

环状RNA(circular RNA，circRNA)是一类具有闭合环状结构、没有5′帽子和3′polyA 尾、耐RNA酶降解的内源性非编码RNA[6-8]。circRNA来源于mRNA前体的反向剪切，根据来源不同主要分为外显子circRNA(exonic circRNAs，ecircRNAs)、内含子circRNA(circular intronic RNAs ,ciRNAs)和外显子-内含子circRNA(Exon-Intron circRNA,EIciRNA)。circRNA广泛存在于多个物种，具有稳定性、保守性、组织和时空特异性[9-12]。越来越多的研究表明circRNAs在多种生物学过程如细胞增殖、分化、癌症发生、先天免疫中扮演着重要的角色[12-16]。此外，circRNA在病毒与宿主互作机制中发挥重要作用[17-19]。然而，circRNA在ORFV感染中的作用尚无文献报道。因此，本研究对ORFV感染的GSF 细胞进行circRNA测序，探索ORFV感染对GSF细胞circRNA表达谱的影响及差异circRNA在ORFV感染中的潜在功能，为ORFV致病机制研究提供新的线索。

1 材料与方法

1.1 试验材料GSF细胞购自中科院细胞库，羊口疮病毒ORFV-JS株由吉林省畜牧兽医科学研究院邵洪泽研究员惠赠。

1.2 主要试剂胎牛血清、高糖DMEM、Ambion mirVana miRNA Isolation Kit、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 均购自ThermoFisher Scientific 公司；Blood/Cell/Tissue Genome DNA Extraction Kit购自天根生化科技(北京)有限公司；pMD-19T载体购自TaKaRa公司；2×SYBR qPCR Mix 购自北京艾德莱生物公司；Green Taq Mix 购自南京诺唯赞生物公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；其他试剂均为分析纯。

1.3 RNA 提取待60 mm培养皿内GSF细胞达到90%聚合度，MOI=1接种ORFV-JS病毒(TCID50=106.2/mL)，37℃吸附1 h 后，吸掉病毒液，加入细胞维持液，继续培养6 h。对照组不加病毒，换为细胞维持液，继续培养6 h。感染组 (OV) 和对照组 (GSF) 各3个生物学重复。参照Ambion mirVana miRNA Isolation Kit 说明书提取总RNA，-80℃保存。

1.4 去rRNA链特异性文库构建及测序样品总RNA 质检合格后，使用epicentre Ribo-Zero试剂盒去除核糖体RNA (rRNA) ，纯化回收的RNA被随机打断成短片段，以此为模板构建6个cDNA文库，文库质检合格后采用Illumina Hiseq4000 测序，测序读长为双端2×150 bp (PE150) 。

1.5 circRNA的鉴定将线性方式无法比对到山羊参考基因组(GCF_001704415.1)的reads使用TopHat-Fusion按照非线性方式继续比对。然后使用CIRCExplore 软件对比对上的reads从头组装，根据circRNA结构特征以及剪接序列特征鉴定circRNA。需满足以下条件：剪切位点两端必须是GU/AG；错配不大于2；Back-spliced junctions reads ≥ 1；2个剪切位点在基因组上距离 ≤ 100 kb。

1.6 circRNA 差异表达分析通过CIRCExplorer对circRNA进行预测，基于公司开发的脚本Scripts in house对不同样本或处理之间的circRNA进行差异统计。差异circRNA的筛选标准为：|log2(fold change)|≥1，P≤0.05。

1.7 差异circRNA的GO和KEGG富集性分析Gene Oncology总共有3个本体，分别描述基因的分子功能(molecular function)、细胞成分(cellular component)、参与的生物过程(biological process)。GO的基本单位是GO term。首先把所有差异circRNA的亲本基因向GO数据库(http://www.geneontology.org/)的各term映射，计算每个term的基因数目，然后应用超几何检验，找出与整个基因组背景相比，在显著性差异表达基因中显著富集的GO条目，其计算公式为：

其中，N为基因总数:n为N中差异表达基因的数目:M为注释为某特定GO term的基因数目:m为注释为某特定GO term的差异表达基因数目。P≤0.05定义为在差异表达基因中显著富集的GO term。差异circRNA的KEGG富集性分析与GO 富集分析类似，不再赘述。

1.8 差异circRNA的验证从差异表达circRNA中挑选相对高表达 (FPKM>10) ，且3个生物学重复中至少在2个样本中鉴定到的circRNA进行qPCR验证。以总RNA为模板，使用随机引物反转录得到cDNA，然后以cDNA为模板，使用divergent 引物扩增circRNA。以2-△△Ct法计算表达差异。GAPDH作为内部对照，每个试验做3次生物学重复。另外，分别以cDNA和基因组DNA(gDNA)为模板，使用divergent引物和convergent 引物进行PCR，PCR产物胶回收后连接到pMD-19T载体，送上海生工公司Sanger测序，鉴定circRNA的反向剪切位点。

1.9 统计分析使用Student’st检验进行显著性分析，P≤0.05 表示差异显著。

2 结果

2.1 测序数据统计数据下机后过滤掉接头序列和低质量原始序列，GSF组(GSF-1、GSF-2、GSF-3)和OV组(OV-1、OV-2、OV-3)分别平均得到83 697 556和91 192 170条有效reads (表1)；6个样本的Q30均大于92%。GSF组和OV组平均有85.2%和86.7%的有效reads线性比对到山羊参考基因组(GCF_001704415.1)，对无法线性比对到参考基因组的有效reads进行非线性比对，GSF组和OV组平均得到946 247条和843 165条back-spliced (反向剪切)reads。此外，将无法比对到山羊参考基因组的reads比对ORFV参考毒株NA1/11(KF234407.1)，OV-1、OV-2、OV-3样本分别有125 619,165 878 和 157 779条reads 比对到ORFV NA1/11毒株基因组，而未感染的GSF组样本比对ORFV基因组的reads数接近为0。将原始数据和处理后的数据上传至NCBI的Gene Expression Omnibus 数据库 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，登录号为GSE121725。

表1 测序数据统计

2.2 circRNA鉴定及特征利用CIRCExplorer软件对6个样本中circRNA 进行鉴定。结果如图1所示，GSF-1、 GSF-2、 GSF-3样本中分别预测到4 639，4 603和4 834个circRNAs；OV-1、OV-2、OV-3样本中分别预测到4 388，5 067和5 802个circRNAs。最终GSF组 ( 至少在1个样本中预测到 ) 总共预测到9 979个circRNAs，OV 组总共预测到10 844个circRNAs，其中4 649个circRNA为两者共有。6个样本中预测到的circRNAs 约98%为外显子circRNAs，剩余的为内含子circRNAs(ciRNAs) 。这些circRNAs在染色体1到染色体29 均有分布，其中，染色体1，2，3，10和11 均产生超过800个circRNA。circRNA的长度主要集中在100～2 000 bp之间。同一亲本基因可产生1个至多个circRNA,其中有超过2 000个亲本基因只能产生1个circRNA。

A.circRNA的数量统计;B.circRNA的种类统计;C.circRNA的染色体分布;D.circRNA的长度分布;E.来源同一亲本基因的circRNA数量统计图1 circRNA的鉴定及特征

2.3 circRNA的差异表达分析设置差异circRNA的筛选阈值为:(|log2( fold change ) | ≥ 1,P≤ 0.05。结果如图2所示，与未感染组 (GSF) 相比，ORFV感染组 (OV) 有59个circRNAs表达上调，92个circRNAs表达下调。

A.差异表达circRNA的柱状图;B.差异表达的circRNA的热图图2 差异表达circRNA统计

2.3 差异circRNA的GO富集分析circRNA功能可能与其亲本基因有关，因此，我们对差异circRNA的亲本基因进行了GO富集分析，分别取“生物学过程”(biological process)“分子功能”(molecular function)和“细胞成分”(cellular component) 3个本体的前20个显著富集 (P<0.05 ) 的GO term作图。结果如图3所示，在细胞成分本体中，显著富集的GO term主要是蛋白质的细胞外基质(proteinaceous extracellular matrix)、质膜(plasma membrane)，胞外区(extracellular region)等； 在分子功能本体中，显著富集的GO term 主要是生长因子结合(growth factor binding)、电压门控钠通道(voltage-gated sodium channel activity)、整合素结合(integrin binding)等；在生物学过程本体中，显著富集的GO term 主要是炎症应答调控(regulation of inflammatory response)、上皮结构维持(epithelial structure maintenance)、细胞迁移的正向调控(positive regulation of cell migration)、泛素蛋白转移酶活性的正向调控(positive regulation of ubiquitin-protein transferase activity)等。

图3 差异circRNA的GO显著富集分析

2.4 差异circRNA 的KEGG富集分析对差异circRNA亲本基因进行KEGG信号通路富集分析， 取前20个显著富集(P< 0.05 )的信号通路作图。结果如图4所示，差异circRNA主要富集在紧密连接(tight junction)、黏着斑(focal adhesion)、血管平滑肌收缩(vascular smooth muscle contraction)、内吞作用(endocytosis)、细胞因子受体相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)等。

2.5 差异circRNA的验证首先筛选相对高表达 (FPKM>10) ，且3个生物学重复中至少在2个样本中鉴定到的差异circRNA，从中随机挑选3个表达上调的circRNAs(circRNA5112,circRNA7880,circRNA8565)和6个表达下调的circRNA(circRNA998、circRNA1000、circRNA1001、 circRNA1684、circRNA3127、 circRNA4287)，设计divergent引物(表2)进行qPCR验证，以GAPDH作为内部对照，以2-△△Ct法计算表达差异。结果表明circRNA7880 表达上调，circRNA1001、 circRNA1684 和circRN3127 表达下调，与circRNA测序结果一致(图5A)。

表2 差异circRNA的qPCR验证

为进一步证明4个候选circRNA为真正的circRNA,分别以cDNA和GSF细胞gDNA为模板，使用divergent引物(扩增circRNA)和convergent 引物(扩增circRNA对应的线性转录本)(表3)进行PCR验证(图5B)，PCR产物胶回收后连接到pMD-19T载体，送上海生工公司Sanger测序。结果表明，以cDNA为模板，使用divergent引物扩增得到circRNA片段(*表示)，而以gDNA为模板无法扩增得到circRNA；以cDNA或gDNA为模板，使用convergent引物均能扩增出circRNA对应的线性转录本。将扩增得到的circRNA片段连接到pMD-19 T simple 载体，Sanger测序发现4个circRNA中反向剪切位点存在(箭头表示)(图5C)。

A.qPCR验证差异circRNA的表达； B.以gDNA和cDNA为模板，使用会聚引物(▷◁)和跨接头引物(◀▶)进行PCR扩增。红色星号表示circRNA;C.Sanger测序确定circRNA的反向剪切位点。箭头指示反向剪切位点图5 差异circRNA的qPCR和Sanger测序验证

表3 差异circRNA的验证引物

3 讨论

近年来，orf在至全国呈广泛流行，给养羊业造成重大经济损失。之前对ORFV致病机制的研究主要集中在ORFV毒力基因或免疫调控基因的挖掘。目前已经证明的ORFV毒力基因主要有ORFV132、ORFV127、ORFV125、ORFV119、ORFV117、ORFV112和ORFV020[20-26]。

ORFV的致病机理仍有很多未知，高通量测序成为研究ORFV与宿主的互作的强有力工具。最近，陈达香等[27-29]分别对ORFV感染的绵羊口腔粘膜、鼠源DC细胞和人皮肤成纤维细胞进行转录组测序，发现差异表达基因显著富集在免疫应答、炎症应答、凋亡和细胞周期等多个生物学过程；孔汉金等[30-31]则分别对ORFV感染的GSF细胞和DC细胞做了蛋白组测序，研究ORFV感染对宿主细胞蛋

白表达谱的影响。大量文献表明宿主circRNA 在病毒感染过程中扮演着重要角色。然而，circRNA在ORFV感染中发挥何种作用尚无文献报道。因此我们对ORFV感染的GSF 细胞进行去核糖体circRNA测序，探究ORFV 感染对GSF 细胞circRNA表达谱的影响及circRNA在ORFV感染中的潜在功能。

在感染组和非感染样本中分别鉴定到9 979 和10 844个circRNA， 这与circRNA在哺乳动物中广泛存在的报道相一致[6,11-12]。6个样本中预测到的circRNAs 约98%来源于外显子，而山羊卵泡细胞中的circRNA有 86% 属于内含子circRNA[32]， 这充分体现了circRNA 组织和细胞特异性的特点。与未感染GSF细胞相比，ORFV感染组总共得到151个差异表达circRNA，来源于90个亲本基因。为了解circRNA的潜在功能，对差异circRNA进行功能富集分析。GO富集分析表明，差异circRNA显著富集在炎症应答调控、上皮结构维持、细胞迁移的正向调控、泛素蛋白转移酶活性的正向调控等生物学过程。KEGG富集分析表明差异circRNA主要富集在紧密连接、黏着斑、血管平滑肌收缩、内吞作用、细胞因子受体相互作用等信号通路。虽然本研究结果表明circRNA广泛参与宿主对ORFV的应答，但差异circRNA的具体功能，尤其是对ORFV复制的影响，将是今后需要进一步研究的课题。