周倩宇,吕晓玲,王改丽,李 姿,贺文琦* (.吉林大学 动物医学学院，吉林 长春 006；.山西农业大学 动物医学学院，山西 晋中 00800；.吉林省畜牧兽医科学研究院，吉林 长春 006)

猪血凝性脑脊髓炎病毒(PHEV)属于单链RNA病毒，是一种典型的嗜神经性冠状病毒，主要感染哺乳期仔猪，引起脑脊髓炎和/或消化系统疾病，以呕吐、衰竭及中枢神经系统障碍为特征[1-2]。该病毒攻击宿主中枢神经系统的神经细胞，但其神经损伤机制尚不清楚[3]。肌动蛋白(F-actin)是真核细胞骨架的重要组成部分，神经细胞的突触可塑性、胞质环流、神经递质传递及信号转导等均受其动态调节所驱动[4]。同时，细胞F-actin骨架重塑在防御病毒入侵、病毒胞内运输及病毒粒子释放过程中扮演重要的角色[5-7]。

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)具有磷脂酰肌醇激酶活性和丝氨酸/苏氨酸激酶活性，通常为激活细胞整合素信号所必需的，参与特定病毒的入侵过程，如单纯疱疹病毒1型(HSV-1)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBv)和腺病毒(adenovirus)[8-11]。哺乳动物中的丝氨酸/苏氨酸激酶Akt又称蛋白激酶B，包括3种亚型Akt1、Akt2和Akt3，它们是PI3K信号转导通路中的关键分子。PI3K调节亚基可与细胞膜上的相应受体结合，对其催化亚基进行激活以催化PIP3形成，随后将Akt募集到细胞膜上而起作用[12-13]。同时，PI3K可通过下游Akt信号调控F-actin细胞骨架重塑过程[14]。尽管PHEV通过劫持整合素α5β1-黏着斑激酶(FAK)-丝切蛋白(CFL)信号调节神经细胞F-actin骨架已被证实[15]，但PI3K信号通路是否在这一过程中起作用尚不明确。

PI3K-Akt通路的下游调控因子众多，其中Ras相关蛋白超家族研究较广泛。Ras蛋白与信号转导有关，Ras蛋白结合GDP时为失活态，结合GTP时为活化态。当细胞外存在信号分子时，Ras蛋白释放出自身的GDP并结合GTP，从而由失活态向活化态转变，最终实现将胞外信号向胞内传递。Ras相关蛋白超家族可分为3个亚家族Rho、Rac和Cdc42，它们可以利用鸟嘌呤核苷酸结合和水解循环发挥作用[16-18]。其中，小G蛋白Rho亚家族GTP酶成员A(Rho A)可以调节细胞骨架系统，特别是肌动蛋白CFL的功能[19]，已经被广泛认可。基于此，本研究拟探究PI3K-Akt-Rho A信号通路是否参与PHEV入侵宿主细胞过程以及该通路在PHEV入侵过程中的调控机制，有助于进一步阐明PHEV诱导神经损伤的致病机制，并寻找有吸引力的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞小鼠神经母细胞瘤细胞(N2a细胞，ATCC：CCL131)在DMEM(6%胎牛血清)中传代培养。

1.2 病毒PHEV CC14毒株(GenBank：MF083115.1)由吉林大学动物医学学院动物病理解剖实验室保存，在N2a细胞中传代繁殖。

1.3 主要试剂鼠源PHEV-N单克隆抗体，由本实验室提取并保存；Cofilin(3318)、p-cofilin(3313)、PI3K(4255)、p-PI3K(4228)、Akt(4685)、p-Akt(4060)等单克隆抗体购于CST公司；GAPDH(60004-1)、FITC-phalloidin F-actin(SA00003-2)等单克隆抗体购于Proteintech公司；PI3K抑制剂(LY 294002)、Rho A抑制剂(CCG-1423)等购于GLPBIO公司；RNAiso-plus(9109)、SYBR Green qPCR试剂盒等购于TaKaRa公司。

1.4 蛋白质免疫印迹PHEV(MOI=1)孵育N2a细胞2 h，并给予药物干预。细胞在RIPA缓冲液中裂解，12 000 r/min离心后，取上清液重悬于5×SDS-PAGE缓冲液中，并煮沸。可溶性细胞裂解产物在12% SDS-PAGE凝胶上分离，转移到0.45 μm孔径硝化纤维素膜上，用5%牛血清白蛋白封闭并孵育抗体。用ImageJ软件进行灰度值分析。

1.5 荧光实时定量PCR(RT-qPCR)利用RNAiso-plus试剂提取细胞总RNA，逆转录为cDNA，采用TaKaRa SYBR Green qPCR试剂盒进行RT-qPCR检测。特异性引物：PHEV-P1，5′-TCT GGG AAT CCT GAC GAG C -3′；PHEV-P2，5′-AGG CGC TGC AAC ACT TAC-3′；GAPDH-P1，5′-CTC AAC TAC ATG GTC TAC ATG TTC-3′；GAPDH-P2，5′-ATT TGA TGT TAG TGG GGT CTC GCT C-3′。

1.6 间接免疫荧光将N2a细胞接种于细胞爬片，用信号分子抑制剂干预细胞后，再用PHEV孵育1 h，用0.1 mol/L PBS洗涤细胞3次，去除细胞表面未结合的病毒，于培养箱培养。用4%多聚甲醛和冷甲醇固定细胞，0.5% Triton X-100透膜处理，5% BSA封闭。孵育FITC-phalloidin特异性标记F-actin或PHEV-N一抗，Hoechst染核后于激光扫描共聚焦荧光显微镜(Olympus FluoView FV1000)下观察。

1.7 统计学分析利用GraphPad Prism 5.0软件进行数据分析，2组间差异用双边非配对t-test检验，3组及以上组间差异用单因素方差分析检验，P<0.05为差异具有统计学意义。*示P<0.05，**示P<0.01，***示P<0.001。

2 结果

2.1 PHEV入侵N2a细胞激活PI3K-Akt信号通路如图1A所示，PHEV感染N2a细胞5 min时PI3K迅速发生磷酸化，随后其磷酸化水平下降，并在20 min后磷酸化作用消失。检测PI3K下游底物Akt活性发现，PHEV感染早期(5～15 min)Akt磷酸化水平较高，20 min后其活性逐渐下降(图1B)。利用灭活的PHEV感染细胞后，PI3K磷酸化水平并未见显著变化(图1C)。该结果表明，PHEV入侵N2a细胞早期可迅速激活PI3K-Akt信号通路。

A，B.Western blot检测PHEV入侵N2a细胞后PI3K/p-PI3K及Akt/p-Akt蛋白水平；C.Western blot检测灭活PHEV入侵N2a细胞后p-PI3K和p-Akt蛋白水平图1 病毒感染时PI3K和Akt蛋白水平变化

2.2 PI3K信号失活抑制PHEV入侵N2a细胞为了检测PI3K-Akt信号通路对F-actin动态重塑及PHEV入侵的影响，使用PI3K特异性抑制剂LY294002(LY)预处理N2a细胞，然后接种PHEV 15 min。结果表明，PI3K抑制剂显著抑制PHEV蛋白表达(图2A)，并呈剂量依赖性抑制PHEV感染效率(图2B)。免疫荧光标记研究表明，5 μmol/L LY可有效降低F-actin骨架结构的稳定性，同时抑制病毒内化作用(图2C)。上述研究证明，PI3K信号通路障碍可破坏F-actin骨架动态稳定性从而抑制PHEV入侵N2a细胞。

A.Western blot检测PHEV蛋白水平；B.RT-qPCR检测PHEV mRNA水平；C.共聚焦显微镜观察F-actin骨架及病毒入侵图2 PHEV入侵及F-actin骨架重塑

2.3 Rho A调控PHEV入侵N2a过程前期研究已证实，PHEV入侵N2a细胞过程中cofilin(CFL)磷酸化和去磷酸化呈动态变化，CFL活性的动态变化可以引起F-actin骨架发生一系列变化[20]。为了研究PI3K信号通路中Rho GTP酶成员Rho A对F-actin骨架重塑和PHEV入侵的影响，我们用Rho A特异性抑制剂CCG-1423(CCG)对N2a细胞进行预处理，并接种PHEV。如图3A所示，CCG-1423可使PHEV感染效率呈药物浓度依赖性降低。免疫荧光检测表明，1 μmol/L CCG-1423可降低病毒内化，并且降低F-actin骨架稳定性(图3B)。上述研究证明，在PHEV感染早期，增强Rho A信号可以调控PHEV入侵N2a细胞。

A.Rho A被抑制后p-CFL和PHEV的蛋白水平检测；B.共聚焦显微镜观察PHEV入侵图3 Rho A对F-actin骨架重塑和PHEV入侵的影响

3 讨论

前期研究工作已证实，PHEV入侵神经细胞可激活整合素α5β1-FAK-CFL信号通路，从而诱导细胞F-actin骨架动态重排[15]。PI3K对整合素信号敏感，且其效应底物Akt可以通过活化下游因子进一步调节细胞功能[21-22]。为了明确PHEV入侵N2a细胞时PI3K-Akt这一经典通路的激活状态，本研究进行了系统地检测。结果显示PI3K/p-PI3K和Akt/p-Akt在PHEV感染早期出现动态变化，提示PHEV有效入侵可以激活PI3K-Akt信号通路。结合PI3K抑制剂处理及F-actin骨架形态学观察，我们进一步证明PI3K-Akt信号通路可以调控PHEV入侵N2a细胞过程。

Rho A作为Rho家族中的一个成员，是调节细胞骨架重构的关键分子，激活后的Rho A可参与调节许多细胞形态和功能变化过程，包括细胞骨架的组装、转录因子的激活、细胞周期的调节和屏障功能的调节等[23]。因此，Rho A又被称为肌动蛋白细胞骨架和细胞形态异质性的分子开关。有研究证明PI3K-Akt信号调控F-actin骨架重塑过程与其下游Rho A信号密切相关[14,24]。因此Rho A信号分子

在PHEV入侵宿主细胞过程中可能发挥重要作用，本研究发现，抑制Rho A功能显著降低PHEV感染效率，表明在PHEV感染早期，增强Rho A信号可以调节PHEV入侵N2a细胞。

综上所述，本研究证实PHEV入侵能够激活PI3K-Akt信号通路，且Rho A作为该信号通路的下游调控因子参与调控F-actin骨架稳定性及PHEV入侵神经细胞过程。该研究为阐明PHEV诱导神经损伤性疾病的发病机制奠定了理论依据，并为抗病毒药物筛选提供了潜在靶标。