姜 胜,杨少青，周 彬，宋泉江，邵春艳，王晓杜*，宋厚辉* (1.浙江农林大学 动物科技学院/动物医学学院，浙江 杭州 311300；2.浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室，浙江 杭州 311300；3.动物健康互联网检查技术浙江省工程实验室，浙江 杭州 311300)

壬基酚(NP)是化工生产中常用的非离子表面活性剂，可在水、土壤和空气中蓄积后进入食物链[1]。NP是一种众所周知的内分泌干扰物，可引起激素失衡，导致生殖和发育障碍[2-3]。大量研究发现，除了具有生殖毒性外，NP还会对肝、肾、神经系统等多种器官造成损伤[4-7]。番茄红素(LYC)是一种类胡萝卜素，广泛分布于番茄、粉红葡萄柚、石榴和西瓜中[8]。LYC因其强大的抗氧化能力而具有多种保健作用，特别是抗肾毒性受到广泛关注。有研究表明，LYC对氨甲叶酸诱导的肾脏毒性(包括组织损伤、生化指标)具有显著疗效[9]。LYC可纠正氧化应激引起的肾脏皮质细胞凋亡，从而对肾功能障碍具有保护作用[10]。此前的研究表明LYC对黄曲霉毒素引起的肾脏线粒体功能损伤具有保护作用[11]。然而，目前关于LYC能否减轻NP诱导的肾脏损伤及其机制的研究尚未见报道。因此，本试验通过建立LYC干预NP诱导小鼠肾损伤实验模型，探究LYC对NP诱导小鼠肾脏损伤的保护机制，为LYC的应用和NP中毒的防护提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与药品试剂清洁级ICR小鼠(40只，雌雄各半，体质量18～23 g)购自杭州子源实验动物科技有限公司，实验动物合格证号为20200514Aabz0105999491；NP(GR，纯度≥99%)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；LYC(UV≥98%)和玉米油均购自北京索莱宝科技有限公司；抗氧化指标(T-AOC、SOD、CAT、GSH-PX和MDA)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；肾功能指标(血清CREA、血清BUN、血清P、尿白蛋白与肌酐比值(UPC))检测由浙江农林大学教学动物医院完成；Akt、p-Akt、p53、Bcl-2、Bax，β-actin的一抗购自北京博奥森生物技术有限公司；羊抗兔和羊抗鼠的二抗购自美国Jackson ImmunoResearch公司。

1.2 药品配置根据NP和LYC脂溶性特点，以玉米油为溶剂，按照0.1 mL/10 g的灌胃量，分别配制成浓度为30 g/L NP溶液和1 g/L LYC溶液，现用现配。根据课题组前期试验结果，将小鼠NP染毒剂量和LYC干预剂量分别定为150 mg/kg和5 mg/kg。

1.3 试验设计与分组将40只清洁级ICR小鼠随机分为4组，每组10只，雌雄各半。对照组(control group，CON)每天8:30经口灌服玉米油0.1 mL，2 h 后经口灌服玉米油0.1 mL；中毒组(nonylphenol group，NPG)每天8:30经口灌服玉米油0.1 mL，2 h后经口灌服150 mg/kg NP溶液；番茄红素对照组(lycopene group，LCG)每天8:30经口灌服5 mg/kg LYC，2 h后经口灌服0.1 mL玉米油；LYC干预组(lycopene+nonylphenol group，LNG)每天8:30经口灌服5 mg/kg LYC，2 h后经口灌服150 mg/kg NP溶液。所有实验动物雌雄分笼饲养，每晚21:00禁食，自由饮水，按试验计划连续灌胃30 d，每5 d称体质量1次，根据体质量变化调整各药物的灌服量，保证试验结束后各组小鼠不少于8只。

1.4 样品采集各组小鼠经口灌服药物30 d后，于第31天8:30准确称量小鼠体质量。测量体质量前，抓取小鼠，采用逼尿法收集适量尿液用于肾脏功能测定。测量体质量后，从小鼠颌下静脉采血0.5 mL，用于检测血中氧化与抗氧化指标和肾脏功能指标分析。安乐死后，采集肾脏并准确测量体质量，将肾脏分为3份，分别用于肾脏组织显微结构观察、抗氧化指标的测定和凋亡通路相关蛋白水平检测。

1.5 日均增体质量及肾体系数测定根据计算公式：(试验后体质量-试验前体质量)/试验天数，计算各组小鼠试验期间日均增体质量。按照计算公式：肾脏质量/试验后体质量×100%，计算各组小鼠肾体系数。

1.6 肾脏组织显微结构测定取适量肾脏组织置于10%甲醛溶液中固定，常规脱水，石腊包埋，制备切片，HE染色后光学显微镜下观察肾脏显微结构变化。

1.7 肾功能的测定取适量血清，使用全自动生化分析仪检测血中CREA、BUN、P离子含量，取适量尿液测量尿中尿蛋白/尿肌酐比值(UPC)，用于评估肾脏功能。

1.8 抗氧化指标的测定取适量肾脏组织与冰浴生理盐水混合后通过组织破碎仪制备成10%匀浆，于4℃下,以3 000 r/min离心15 min，取上清储存-80℃备用。将肾脏组织匀浆分别按照各抗氧化指标试剂盒说明书进行处理后，用酶标仪测定肾脏中各种抗氧化指标的含量。

1.9 肾脏中凋亡通路蛋白测定蛋白提取：取-80℃ 冻存的肾脏组织于冰上解冻后，取50 mg组织放入预冷的玻璃匀浆器，加入200 μL裂解液和5 μL 蛋白酶抑制剂PMSF，冰浴中充分研磨成匀浆，冰上静置5 min后移入1.5 mL离心管中，超声10 次，每次10 s，间隔4 s；4℃ 12 000 r/min离心5 min；离心后上清即为肾脏组织全蛋白提取物。

蛋白质量浓度测定及样品制备：利用BCA试剂盒测定肾脏组织蛋白提取物质量浓度。根据蛋白质量浓度，将上样体积定为15 μL(20 μg)，加入3 μL 5×SDS上样缓冲液，混合均匀，沸水浴10 min，冷却后分装，-80℃保存。

蛋白含量表达检测：取15 μL变性蛋白样本进行SDS-PAGE后，采用湿转法将目的蛋白从凝胶转移至PVDF膜上，随后用5%脱脂奶粉室温孵育2 h；封闭结束后，用TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min；洗膜结束后，将膜置于已稀释相应倍数的一抗中4℃孵育过夜；一抗孵育结束后，再次用TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min；洗膜结束后，将膜置于相同种属的二抗中室温孵育1 h；孵育结束后，用TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min；洗膜结束后，在膜上滴加ECL显色液，放入凝胶成像系统中曝光成像。以β-actin为内参蛋白，用ImageJ软件进行蛋白条带灰度值的分析，最终计算出目的蛋白相对表达量。

1.10 统计学方法试验所得数据表示为“均值±标准误”，使用GraphPad Prism 8.0软件进行数据分析并制图，实验数据采用单因素方差分析，运用t检验进行数据配对差异分析，P<0.05为显著性差异标准，P<0.01为极显著性差异标准。

2 结果

2.1 体质量增长系数及肾体系数试验过程中，各组实验小鼠均未出现死亡，但与CON小鼠比较，NPG小鼠日增体质量显著降低(P<0.05)，而与CON小鼠比较，LCG小鼠和LNG小鼠日增体质量无显著性差异(P>0.05)；与NPG小鼠比较，LNG小鼠日增体质量显著升高(P<0.05)(图1A)。各组实验小鼠肾体系数统计结果显示，与CON小鼠比较，NPG小鼠肾体系数显著升高(P<0.05)；与NPG小鼠比较，LNG小鼠日增体质量显著降低(P<0.05)(图1B)。

2.2 LYC干预对NP诱导小鼠肾脏组织结构变化的影响如图2所示，NPG小鼠肾小囊腔萎缩(绿色箭头)，肾小囊腔内有多量嗜酸性物质(黑色箭头)，肾小管扩张(黄色箭头)(图2B)，损伤严重；LNG小鼠肾小囊腔萎缩(黑色箭头)，肾小管上皮细胞形态结构正常、排列紧密(图2C)，损伤轻微；LCG小鼠与CON小肾脏结构未见明显差异。

2.3 LYC干预对NP诱导小鼠肾功能的影响如图3所示，与CON比较，NPG小鼠血清中UREA、CREA和P离子含量显著升高(P<0.01)，经过LYC干预后，与NPG小鼠比较，LNG小鼠血清中UREA、CREA和P离子含量显著降低(P<0.05，P<0.01)。与CON比较，NPG小鼠尿液UPC值显著升高(P<0.01)；经过LYC干预后，与NPG小鼠比较，LNG小鼠尿液UPC值显著降低(P<0.01)。

2.4 LYC干预对NP诱导小鼠肾脏氧化损伤的影响由图4可知，与CON比较，NPG小鼠肾脏MDA含量显著升高(P<0.05)；经LYC干预后，LNG小鼠肾脏MDA含量显著下降(P<0.01)。与CON比较，NPG小鼠肾脏抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px活性及总抗氧化能力(T-AOC)均显著下降(P<0.05)；经LYC干预后，LNG小鼠肾脏抗氧化酶活性和总抗氧化能力均显著升高(P<0.05)。

2.5 LYC干预对NP诱导小鼠肾脏凋亡通路蛋白表达的影响由图5可知，与CON比较，NPG小鼠肾脏p53、Bax蛋白的表达水平显著升高(P<0.01)，PI3K、p-PI3K、p-Akt、Bcl-2、Akt蛋白表达水平显著降低(P<0.01，P<0.05)；与NPG比较，LNG组小鼠肾脏p53、Bax表达水平显著降低(P<0.01)，PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。

CON.对照组；NPG.NP染毒组；LCG.LYC对照组；LNG.LYC干预NP染毒组图5 LYC干预对NP染毒小鼠肾脏PI3K/Akt/p53通路蛋白表达的影响

3 讨论

NP是一种典型的内分泌干扰物，具有抗雄激素和雌激素样作用[12]。关于NP毒性的研究主要集中在其生殖毒性方面[13-14]，但有研究表明NP还可以引起氧化应激，并在多器官中产生具有高度活性的膜毒性中间产物[15-16]。LYC是一种天然类胡萝卜素抗氧化剂，是β-胡萝卜素的异构体，其在细胞培养和动物模型中清除自由基的活性已被证实[17]。因此，LYC能够降低氧化应激介导的多种疾病风险[18]，而且有研究证实，LYC可以保护黄曲霉毒素诱导的小鼠肾脏损伤[19]。尽管NP在环境中分布广泛，对人和动物的健康危害极大，但LYC对NP毒性保护作用的具体机制尚未阐明。本研究旨在探讨NP对肾脏损伤和氧化应激的影响，以及应用LYC能否逆转NP诱导的小鼠肾脏组织氧化应激和组织病理学改变及其机制。

肾脏是机体清除体内代谢产物、废物及毒物的重要器官，有研究表明NP能够导致大鼠肾脏组织损伤[20]。本研究肾脏组织病理学结果显示NP染毒后小鼠肾小囊腔萎缩，腔内有多量嗜酸性物质，肾小管扩张；肾体指数变化结果显示NP染毒后小鼠肾体指数升高，结合组织学结果表明NP染毒后小鼠肾脏肿胀，相对质量增加；而小鼠日增体质量则在染毒后显著降低。病理组织学结果、肾体指数和小鼠日增体质量变化结果均显示LYC干预可逆转NP染毒导致的肾脏质量和组织学变化变化。虽然对NP暴露后小鼠日增体质量和肾体系数变化的检测属于非功能性评估，但日增体质量和肾体指数变化可以直观体现出外源性毒物的毒性作用[17]。研究发现，LYC不仅可抑制肾细胞癌变，还可抵抗多种毒物对机体的肾毒性[21-22]，保护肾脏组织。本研究结果表明，LYC干预后NP染毒小鼠血清中CREA、UREA和尿中UPC值均下降。综合病理组织学结果及小鼠日增体质量变化和肾体指数3组数据，说明LYC能干预NP诱导的小鼠肾毒性。

MDA是氧化应激引起脂质过氧化的生化标志物[23]，是指示机体氧化平衡状态的最常用指标。本研究结果显示,NP染毒小鼠肾脏组织MDA显著升高，说明小鼠体内的氧化与抗氧化平衡状态已经被破坏。NP是亲脂性化合物，因此细胞可能是脂质过氧化的靶点。研究发现，NP暴露可对机体产生毒性，增加氧自由基和脂质过氧化，抑制抗氧化酶活性，氧自由基的增加导致细胞发生膜脂过氧化，导致细胞损伤或死亡，并损害其周围组织的细胞结构和功能[24]。经LYC预处理，小鼠肾脏MDA水平比NP染毒小鼠显著降低，说明LYC可以纠正机体氧化与抗氧化的失衡。经LYC干预后小鼠MDA水平降低的同时，肾脏总抗氧化能力(T-AOC)和抗氧化酶(SOD、CAT和GSH-Px)活性增强，说明抗氧化作用是LYC抵抗NP毒性作用机制之一。此外，LYC分子结构中含有开链多烯或富电子芳香环结构，使得LYC能有效地清除超氧阴离子自由基，具备极强的抗氧化能力[25-26]。因此，LYC对NP毒性的保护作用与其直接清除自由基和增强抗氧化系统的抗氧化能力有关。

生理状态下的细胞凋亡在控制细胞数量和维持细胞增殖活性中起着重要作用[27]，涉及p53、Bcl-2等多个基因和蛋白家族的表达与调控作用。研究证实，PI3K/Akt信号调控通路与细胞凋亡和增殖密切相关[28]，该通路可调控下游关键分子p53、Bcl-2及Bax等分子参与内源性细胞凋亡。p53蛋白是凋亡通路中关键蛋白，可以下调抗凋亡蛋白Bcl-2，上调促凋亡蛋白Bax的表达，破坏Bcl-2和Bax平衡状态，促使线粒体内促凋亡蛋白外排，引起细胞凋亡。因此Bcl-2和Bax平衡状态的破坏可以促进凋亡。研究发现，磷酸化的Akt可以抑制p53的表达[29]。本研究发现NP暴露可抑制PI3K蛋白表达，下调Akt磷酸化水平，而凋亡通路中关键分子p53蛋白在NP暴露小鼠中表达水平升高，说明NP可能抑制PI3K/Akt通路，上调p53蛋白表达水平，从而促进肾脏细胞凋亡发挥毒性效应。经LYC处理后，检测凋亡通路蛋白表达水平，发现LYC可上调PI3K、p-Akt蛋白表达，抑制p53、Bax蛋白表达，说明LYC可能通过激活PI3K，上调Akt的磷酸化水平，抑制下游p53/Bax分子，对NP诱导肾脏细胞的过度凋亡发挥保护作用。本研究证实LYC能够激活PI3K/Akt通路，下调p53蛋白表达，激活PI3K/Akt/p53通路，抑制Bax蛋白表达，激活Bcl-2蛋白，抑制肾脏细胞凋亡。

综上所述，LYC对NP诱导的小鼠肾脏损伤具有保护作用，这与LYC增强肾脏抗氧化能力，抑制抑制PI3K/Akt/p53细胞凋亡通路有关。