黄彦臻 王何欣 吴超男 包立军 苏 超 钱永华

(西北农林科技大学蚕桑丝绸研究所，陕西杨凌 712100)

桑椹在成熟的过程中易患菌核病，导致其品质与产量下降。桑椹菌核病是一种土壤传播的真菌病，在全国果桑种植基地均有不同程度发生，是影响桑果产量的第一大病害，其连年爆发，发病病势猛、感染速度快且扩散范围大，对果桑产业的发展造成非常大的危害[1]。目前，桑椹菌核病的防治主要以化学药剂防治为主，使用最多的杀菌剂有多菌灵、甲基托布津等[2]。由于化学农药的长期使用，病原菌抗性逐渐增强，药效降低，桑椹农药残留增加[3]，环境污染加重。因此，利用生物防治桑椹菌核病越来越受到人们的重视[4]。

植物精油作为从植物中提取的天然有效物质，许多种植物精油的优异的抗菌能力已被证实。因其高效、低毒、环境友好等特点，将其作为植物源杀菌剂已成为当下的研究热点[5]。植物精油作为一种新型的植物源杀菌剂，相较于传统化学杀菌剂，其对人类和环境的风险更小，符合人们对绿色防控的需求，具有潜在的应用价值和广阔的市场。课题组前期研究发现，八角茴香提取物和丁香酚能够有效抑制桑椹菌核病病原生长[6-7]，本文拟对八角茴香精油和丁香精油的抑菌效果进行研究，考察其联合抗菌作用，并进一步对其制剂进行田间防效试验，以期为桑椹菌核病生物防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

桑实杯盘菌(Ciboriashiraiana)，购自中国典型培养物保藏中心，菌株保藏编号CCTCC AF 2014019。

1.1.2 供试药剂

八角茴香油、丁香油(上海源叶生物有限公司)；8%八角微乳、8%丁香微乳、6%丁香八角混合微乳(即8%八角ME、8%丁香ME、6%丁·八ME，西北农林科技大学蚕桑丝绸研究所提供)；Tween-80(成都市科隆化学品有限公司)；PDA培养基(北京陆桥技术股份有限公司)；70%可湿性甲基托布津粉剂(山西上格之路生物科学有限公司)；50%多菌灵可湿性粉剂(四川润尔科技有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 精油抑菌活性测定

供试样品溶液的配置：丁香油、八角茴香油分别用1% Tween-80蒸馏水溶液溶解，采用二倍连续稀释法配成不同质量浓度的药液。

试验方法：吸取2 mL药液，加入经灭菌处理并冷却至50 °C左右的18 mL培养基中，立即混匀并倒入无菌培养皿中。用6 mm打孔器在菌落边缘菌丝生长茂盛处打孔，接种至加药的PDA平板中央,于28 °C培养72～96 h。观察抑菌情况,并采取十字交叉法测量抑菌圈直径。以1% Tween-80蒸馏水溶液作为空白对照，重复3次，结果取平均值。

最小抑菌浓度(MIC)定义为完全没有菌体生长的植物精油浓度。

1.2.2 精油复配的抑菌性能测定

以两种抑菌剂的MIC值为基础，配制一系列浓度的抑菌剂，即1 MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC，并将药液进行两两联合。采用菌丝生长速率法测得复配液的MIC值。以分级浓度抑制指数(fractional inhibitory concentration, FIC)作为判断依据。

FIC=MICA(联合)/MICA(单用)+MICB(联合)/MICB(单用)

FIC的判断标准为：当FIC ≤ 0.5时，两种药物之间起协同作用；当0.5< FIC ≤ 1.0，两种药物之间起相加作用；当1.0< FIC < 4.0，两种药物之间无相关作用；FIC ≥4.0时，两种药物起拮抗作用。通过FIC的判定标准，采用相加后FIC值最小的试验药物组合来计算药物的最佳复配比。

1.2.3 不同药物防治桑椹菌核病的田间试验分析

试验地：西北农林科技大学杨凌农业综合试验示范站，无核大十果桑品种，树龄7 a，每667 m2栽植270株。

药物设置：8%八角ME、8%丁香油ME、6%丁·八ME共3个植物源杀菌剂处理区，以实验室实验结果为参考分设3种浓度，设70%甲基托布津WP(粉剂)+50%多菌灵WP(粉剂)1 000倍液1个常规农药处理区，共10个处理区和1个清水对照(CK)区；每个小区5株桑树，对桑树常规喷药，以叶面滴水为度，在桑椹收获前30 d停止用药。

喷药时间与次数：于4月1日(萌芽期)、4月8日(初花期)、4月18日(盛花期)各喷药1次，共用药3次。

发病率调查：在桑植成熟期进行发病率调查，每处理桑树按东、南、西、北、上五个方位取5枝桑条进行调查，共25个枝条。调查其病果数，计算发病率及防治效果。

发病率=病果粒数/总果粒数×100%

校正防效=[(对照区发病率-药剂处理区发病率)/对照区发病率]×100%

采用最小显著差异法(LSD)对各处理区的最终发病率进行方差分析。

1.2.4 农药残留检验方法

在桑椹旺盛成熟期间，从常规农药处理区的每株桑树上随机选择1个枝条，采摘成熟桑果收集保存。对其进行农药残留量检验，50%多菌灵和70%甲基托布津成分按照 GB/T 20769- 2008《水果和蔬菜中450种农药及相关化学品残留量的测定：液相色谱-串联质谱法》方法检验。

1.2.5 数据处理

采用SPSS Statistics 23软件对试验数据进行单因素方差分析与多重比较。所有结果均以“平均值±标准差”的形式表示。

2 结果与分析

2.1 八角茴香油和丁香油对桑实杯盘菌的抑制效果

由表1可知，八角茴香油与丁香油均表现出良好的对核盘菌的抑制效果，并随着浓度的增大抑制率逐渐增强。在同一试验条件下，相同浓度的八角茴香油效果优于丁香油。最小抑菌浓度(MIC)是指抗菌药物能够完全抑制菌体生长的最低浓度。当用质量浓度为0.25 mg/mL的八角茴香油处理时，抑制率达到了100%，即八角茴香油的对核盘菌的MIC值为0.25 mg/mL。当丁香油质量浓度增大到0.5 mg/mL时，其抑菌率为100%，即丁香油对核盘菌的MIC值为0.5 mg/mL。

表1 不同浓度八角茴香油和丁香油对桑实杯盘菌的抑菌率

2.2 精油复配的抑菌性能测定

将八角茴香油与丁香油的供试浓度两两组合复配，抑制效果见表2。MICA和MICB分别表示八角茴香油和丁香油对桑实杯盘菌的MIC值，结合两者各自的最小抑菌浓度计算FIC值。由表可知，丁香油和八角茴香油复配后对核盘菌的最小抑菌浓度为1/2 MICB∶1/2 MICA，质量比为2∶1，联合使用后对核盘菌的抑菌效果为相加作用(FIC=1)。

表2 八角茴香油和丁香油复配物对桑实杯盘菌的抑制效果

2.3 田间药效试验

从表3可以看出，所有处理组均出现了发病现象，说明菌核病对桑椹危害十分普遍；同一生物制剂不同处理对桑椹菌核病的防效存在差异，浓度越大，防效越好。单一精油微乳处理组中，8%丁香微乳200倍液防治效果最差，矫正防效只有48.83%，八角微乳剂防治效果明显优于丁香微乳剂。混合微乳剂的效果因为浓度的原因，矫正防效最高，达85.38%，但在相同使用倍数下，与八角微乳无显著性差异。

表3 不同药剂组合对桑椹菌核病的防治效果

2.4 农药残留检验

桑椹成熟期(药后40 d)，采摘成熟桑果检验常规农药处理区内农药成分的残留量，并将检验结果与国家食品安全标准农药最大残留限量[8]进行比对 (参照水果农药最大残留限量标准)。结果显示，50%多菌灵残留量2.19 mg/kg，比国家标准0.5 mg/kg超标4.38倍。70%甲基托布津残留量0.12 mg/kg，其残留量应综合考虑其降解产物多菌灵的残留[9]，所以远大于国家标准0.5 mg/kg。

3 小结与讨论

本文探究了植物精油——八角茴香油和丁香油对桑椹菌核病病原菌的抑制效果，发现两种精油均有很强的抑菌能力，其最小抑菌浓度八角茴香油为0.25 mg/mL，丁香油为0.5 mg/mL。当丁香油和八角茴香油以2∶1的质量比复配时，对桑实杯盘菌的抑制表现出相加作用。

以实验室试验结果为参考，两种植物精油为原料制成的植物源杀菌剂在田间防效试验中也取得了良好的防治效果。试验结果表明，8%八角ME 100倍液和6%丁·八ME 100倍液对菌核病的防治效果明显高于70%甲基托布津WP+50%多菌灵WP 1 000倍液，对菌核病具有良好的防治效果。农药残留检验结果表明，此区域常用农药50%多菌灵和70%甲基托布津的残留量(参考水果农药最大残留限量)高于国家标准。虽然目前还没有桑椹相关的残留限量标准且未见列入农业监管检测对象，考虑到生产中存在的安全性风险，筛选新型的防治药剂十分必要。