张 禹 李亚洁 黄静雅 朴美兰 李树英 任立松

(1.辽宁省蚕业科学研究所,辽宁凤城 118100;2.辽宁省海洋水产科学研究院，辽宁大连 116023)

柞蚕(Antheraeapernyi)是我国特有的经济昆虫，在黑、吉、辽等9个省都有广泛分布，柞蚕产业资源非常丰富，每年可产柞蚕茧7.5万t，占世界总产量的90%以上[1-2]。柞蚕蛹营养组分及含量十分丰富，是柞蚕一个世代营养物质积累的高峰期[3]，以活的柞蚕蛹培育的蛹虫草，在形态上与野生蛹虫草基本相同，其主要化学成分和营养成分与冬虫夏草更接近，其中虫草素含量比冬虫夏草高出数倍甚至数十倍，具有镇静、抗炎、降低血清胆固醇、抑制肿瘤、提高机体免疫功能等作用。目前利用柞蚕蛹培育蛹虫草技术已经成熟，正逐步向着规模化、产业化发展[4-8]。为了适应市场发展需要，本试验选取辽宁省 5 个现行品种的柞蚕蛹培育蛹虫草，通过对蛹虫草生长性状及主要成分进行调查与分析，旨在为培育高品质的柞蚕蛹虫草筛选出更适宜的柞蚕品种，同时为蛹虫草资源的开发和推广利用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试柞蚕蛹品种为辽宁省现行的5个主要生产品种，分别为9906、抗大、988、青一和582，均由辽宁省蚕业科学研究所提供。

蛹虫草菌种为本实验室保存。

1.2 培养基的制备

土豆去皮200 g，切成小块，加水煮沸30 min后过滤。在滤液中加入蔗糖20 g，磷酸二氢钾3.0 g，硫酸镁1.5 g，维生素B1 20 mg，蛋白胨10 g，加水至1 000 mL，用三角瓶分装(固体培养基加琼脂18 g)，在121 ℃下灭菌40 min，备用。

1.3 液体菌种制备

将蛹虫草试管母种接入上述液体培养基中，24 ℃恒温静止培养2 d后，再振荡培养5～7 d,4层纱布过滤。备用。

1.4 柞蚕蛹虫草培养

将不同品种的柞蚕蛹用75%乙醇迅速擦洗蚕蛹体表。尤其是节间膜处(或将蚕蛹用75%乙醇浸泡2 min)，再用无菌水洗去残留酒精，放在无菌托盘中晾干，注射接种上述蛹虫草菌液，每只蚕蛹注射量0.2～0.4 mL，然后把接种后的柞蚕蛹放在消过毒的塑料盘中，送入培养室内培养，培养室的温度控制在18～22 ℃，相对湿度60%左右。7～8 d后，柞蚕蛹僵化，继续在避光条件下培养，温度提高到20～22 ℃，相对湿度提高到65%～70%，再经过7～8 d，通过温差刺激，补光诱发原基形成，原基形成后室内温度控制在18～22 ℃，相对湿度提高到75%，保证空气新鲜，50 d后采收。

1.5 主要营养成分分析

取不同品种柞蚕蛹培育的蛹虫草，各样品经50 ℃烘干至恒重磨成粉末，送至谱尼测试公司测试。采用GB/T5009.124-22016方法测定氨基酸的含量；采用GB/T5009.5-2016第一法测定蛋白质的含量；采用GB/T5009.6-2016第一法法测定脂肪的含量。

1.6 主要活性成分分析

各样品经50 ℃烘至恒重后磨成粉末，测定各活性成分。NY/T2116-2010(高效液相色谱法)所述方法及高碘酸钠比色法，分别测定样品中的虫草素、腺苷、多糖、虫草酸含量。

1.7 超氧化物歧化酶(SOD)活性测定

采用南京建成SOD试剂盒测定，将1 g子实体组织在100 mL纯净水中充分匀浆，取40 μL匀浆液测定。定义为：每克组织在1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位(U)。计算公式：

总SOD活力(U/克组织湿重)=[(对照OD值-测定OD值)/对照OD值]÷50%×[(反应液总体积mL)/取样量mL]÷匀浆液浓度g/mL

1.8 数据处理

试验数据用“平均值±标准差”表示，采用SPSS17.0软件对试验结果进行单因子显著性检验，以P<0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 不同品种柞蚕蛹培育蛹虫草生长性状

不同品种柞蚕蛹培育蛹虫草生长性状见表1。

由表1可以看出，不同品种柞蚕蛹接种蛹虫草菌后，蛹体僵化时间基本相同，一般集中在4～6 d；而僵化率确有明显区别，其中抗大和582品种表现较好，均在95%以上，明显好于其他3个品种(P<0.05)；从子座数量、长度和全草鲜重来看，抗大和582品种优势也明显高于9906、988和青一(P<0.05)。总体而言，抗大和582品种好于9906、988和青一(P<0.05)。

表1 接种不同品种柞蚕蛹虫草生长性状调查结果

2.2 不同品种柞蚕蛹培育的蛹虫草氨基酸组成及含量分析

由表2可知，5个品种柞蚕蛹培育的蛹虫草均含有18种氨基酸，其中包括 8 种人体必需氨基酸，其氨基酸总量和必需氨基酸质量分数从高到低依次为抗大、582、9906、青一、988，天冬氨酸和谷氨酸是食品中重要的鲜味物质，同属于鲜味氨基酸，5个品种柞蚕蛹培育的蛹虫草中天冬氨酸和谷氨酸含量最多，均超过2%，必需氨基酸/非必需氨基酸( EAA/NEAA)均在65%以上，其中抗大明显高于其他品种(P<0.05)， 根据 FAO/WHO 推荐的较理想蛋白质要求，柞蚕蛹虫草属优质蛋白质源。谷氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸和苯丙氨酸构成了氨基酸组分中的药效氨基酸[9]，所测5个品种柞蚕蛹培育的蛹虫草样品中药效氨基酸含量从高到低依次是582、抗大、9906、988、青一。

表2 不同发育程度柞蚕蛹培育的蛹虫草氨基酸组成与含量

2.3 不同品种柞蚕蛹培育的蛹虫草主要活性成分分析

5个品种柞蚕蛹培育的蛹虫草主要活性成分含量如图1A和图1B所示。

图1 不同品种柞蚕蛹培育的蛹虫草主要活性成分含量

由图1A可以看出，虫草素含量由高到低依次为582、9906、抗大、988、青一，且前4个品种显著高于青一(P<0.05)；腺苷含量最高的是988，青一最低，另外3个品种差异不显著。由图1B可知，虫草酸含量由高到低依次为582、抗大、988、青一、9906；虫草多糖含量最高的是抗大，9906最低，各品种间无显著差异。

2.4 不同品种柞蚕蛹培育的蛹虫草中超氧化物歧化酶(SOD)活力分析

图2为测定的不同品种柞蚕蛹培育的蛹虫草中SOD活力。结果显示，不同品种柞蚕蛹培育蛹虫草中的 SOD 酶活力有一定的差异，其中582品种的蛹虫草中SOD 酶活力最高，达到394.0 U/g，其次是抗大，为313.0 U/g，988最低，为 274.0 U/g。

图2 不同品种柞蚕蛹培育的蛹虫草SOD活力

3 结论与讨论

通过对5个品种柞蚕蛹培育的蛹虫草的生长性状与成分含量比较分析，结果表明，柞蚕蛹感染蛹虫草菌后僵化时间基本相同，僵蛹率存在显著差别，表现较好的抗大和582品种僵蛹率均在95%以上，明显高于9906、988和青一，且抗大和582品种在子座数量、长度和全草鲜重上也与其他3个品种差异显著，说明就生长性状而言，抗大和582更好，可能与柞蚕蛹品质有关。氨基酸作为蛋白质的基本组成单位，同时参与构成酶、激素和维生素，在调节生理机能、催化代谢过程中起着十分重要的作用[9-10]，对蛹虫草中的氨基酸含量测定结果表明，不同品种柞蚕蛹栽培蛹虫草中氨基酸种类均为 18 种，但蛹虫草中各氨基酸的含量不同，其氨基酸总量与必需氨基酸总量由高到低依次为抗大、582、9906、青一和988，与生长性状基本一致。另外，蛹虫草中主要活性成分含量及SOD酶活力也有差异，其中虫草素与腺苷含量相对较高的品种是582、9906和抗大，虫草酸和虫草多糖含量相对较高的品种是582、抗大和988， SOD 酶活力相对较高的品种是582、抗大和9906。综合上述，建议培育柞蚕蛹虫草最好选择582、抗大或9906柞蚕品种，可以生产出更高品质的蛹虫草。

随着人们的保健意识不断增强，柞蚕蛹虫草的药理作用不断被发掘，柞蚕蛹虫草作为潜能巨大的药食同源物质，正被人们广泛接受。朱荣才等[11]利用河南特有的一化性柞蚕蛹培育蛹虫草，虫草素含量是野生冬虫夏草的 5.7倍，虫草多糖是野生冬虫夏草的 5.6倍，虫草酸两者接近，总氨基酸的含量是野生冬虫夏草的 2 倍以上。孟楠等[12]考察了不同发育程度柞蚕蛹对培育蛹虫草的生长性状与品质的影响，发现柞蚕滞育蛹或轻度发育蛹可以生产出高品质的蛹虫草。本研究利用不同品种柞蚕蛹培育蛹虫草，对生长性状与成分含量进行比较，为工厂化生产出高品质柞蚕蛹虫草奠定基础。