韦卫宁， 许立拔， 王孝勋*， 杨雅钧， 何石燕， 周彩燕

(1.广西中医药大学 药学院， 广西 南宁 530200; 2.广西壮瑶药重点实验室， 广西 南宁 530200)

0 引言

细胞在遗传机制下有序的凋亡,可以清除突变或老化受损的细胞,保证组织器官功能的正常运行,但急性、大量的细胞凋亡会导致组织器官损伤和功能异常[1].氧化应激损伤及其所致细胞凋亡是多种疾病发生发展的发病机制之一,包括肺,被认为是特发性肺纤维化的主要危险因素[2].在临床上,吸烟、辐射、石棉、粉尘等危险因素,均可启动机体发生氧化应激反应.减轻机体过度的氧化应激水平,抑制肺细胞过度凋亡,是防治多种肺部疾病发生发展的关键[1,3,4].而中药及其有效成分天然的抗氧化能力及其对细胞凋亡的双向调节作用,成为肺病治疗、研究的重点和热点.

对叶百部总生物碱是从对叶百部中获取的多种生物碱的集合体,包括对叶百部碱、百部新碱、新对叶百部碱和金刚大碱等[5].有研究表明,对叶百部总生物碱具有抗肺纤维化作用、镇咳等作用[6-8],但其抗氧化应激作用尚未见报道.因此,本研究旨在观察对叶百部总生物碱对H2O2所致中国仓鼠肺细胞V79增殖、凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响,为对叶百部总生物碱在抗氧化应激和抑制病理状态肺细胞凋亡机制下,用于临床肺部疾病的防治及深入研究,提供实验和理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

1.1.1 主要材料及试剂

中国仓鼠肺细胞(V79)(KCB200811YJ),购自中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库.对叶百部,产地为广西百色田林高龙乡,经广西中医药大学中药鉴定教研室韦松基教授鉴定,所采集的块根归属百部科百部属对叶百部StemonatuberosaLour..对叶百部总生物碱,广西壮瑶药重点实验室,批号:20210315.3%H2O2溶液,美国SIGMA-ALDRICH公司,批号BCCC4031; 维生素E,养生堂药业有限公司,批号:20210320; 胎牛血清(FBS),浙江天航生物科技股份有限公司,批号21070701;ECL发光试剂盒和β-actin抗体,美国AFFINITY公司,批号7525和12W2944; 山羊抗兔的二抗和山羊抗鼠的二抗,北京中杉金桥生物技术有限公司,批号为141987和214800903; Bax抗体,英国Abcam公司,批号GR3180247-24; Bcl-2抗体,美国Genetex公司,批号42970; Cleaved caspase-3抗体,美国Novus公司,批号g-2; DMEM培养液、Annexin-V/PI 凋亡检测试剂盒,江苏凯基生物技术股份有限公司,批号20210910和20210803; 噻唑蓝(MTT)和RIPA裂解液,北京索莱宝科技有限公司,批号1223G0531和20210902; 苯并咪唑荧光染料(Hoechst 33258)染液,上海碧云天生物技术有限公司,批号110520210423.

1.1.2 主要仪器

Centrifuge5417R型低温高速离心机,德国Eppendorf公司; CKX53型倒置显微镜,日本Olympus公司; C170型CO2培养箱,德国Binder公司; DS-11型超微量紫外可见分光光度计,美国Denovix公司; DYCZ-24DN型电泳仪,北京六一生物科技有限公司; WSE-4040型半干转膜仪,日本ATTO公司; FilterMax F3多功能酶标仪,美国Molecular Devices公司.

1.2 实验方法

1.2.1 对叶百部总生物碱的制备

取对叶百部干燥块根粉1 000 g,过3号筛,加10倍量甲醇超声浸提40 min,过滤,挥干溶媒,加4%盐酸2 500 mL充分混匀,抽滤,滤液用氨水调pH至9～10,用氯仿萃取至无色,萃取液挥干溶媒,置于冷冻干燥机冷冻72 h,得浸膏即为对叶百部总生物碱(得膏率0.52%,浸膏g∶原药材g= 1∶192.31,使用酸性染料比色法检测对叶百部总生物碱质量分数为86.22%).

1.2.2 细胞培养

中国仓鼠肺细胞(V79)细胞,使用10% FBS,1%青链霉素中性DMEM完全培养液培养,置于CO2培养箱保持37 ℃、5%CO2和饱和湿度.

1.2.3 药液的配制

对叶百部总生物碱先使用DMSO制备成浓度为250 mg/mL的储存液,冷冻避光保存,临用现溶,加适量DMEM培养液稀释得到所需药液浓度(DMSO终体积分数不超过0.1%).

1.2.4 对叶百部总生物碱对V79细胞增殖的影响

计数处于对数生长期的V79细胞,稀释至细胞浓度为2×105个/mL,取100μL按设计接种至96 孔板中,2.0×104个/孔,另选6孔为调零孔仅加不含细胞的新鲜完全培养液200μL,剩余孔添加PBS液200μL.培养24 h,含细胞孔更换新鲜含药完全培养液,每孔添加200μL,对叶百部总生物碱终浓度分别为 10μg/mL,22μg/mL,50μg/mL,112μg/mL和250μg/mL,另设空白孔,空白孔仅加新鲜完全培养液200μL,重复6个复孔.继续培养24 h,每孔添加5 mg/mL的MTT染液20μL,置培养箱正常培养4 h后,吸干孔中液体,每孔添加DMSO 100μL并置于酶标仪中37 ℃振荡10 min,在570 nm波长处检测吸光度(OD)值,并计算细胞存活率(%)[9].细胞存活率(%)=100%×(测定组OD值-调零孔OD均值)/(空白组OD均值-调零孔OD均值).

1.2.5 H2O2致V79细胞损伤模型的建立

计数处于对数生长期的V79细胞,稀释至细胞浓度为2×105个/mL,取100μL按设计接种至96 孔板中,2.0×104个/孔,剩余孔添加PBS液200μL.培养24 h,含细胞孔更换新鲜含H2O2完全培养液,每孔添加200μL,H2O2浓度分别为0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0和8.0 mmol/L,另设空白孔,空白孔仅加新鲜完全培养液200μL,重复6个复孔.继续培养24 h,每孔添加5 mg/mL的MTT染液20μL,置培养箱正常培养4 h后,吸干孔中液体,每孔添加DMSO 100μL并置于酶标仪中37 ℃振荡10 min,在570 nm波长处检测吸光度(OD)值,并计算细胞存活率(%).

1.2.6 对叶百部总生物碱对H2O2所致V79细胞损伤的影响

计数处于对数生长期的V79细胞,稀释至细胞浓度为2×105个/mL,取100μL按设计接种至96 孔板中,2.0×104个/孔,另选6孔为调零孔仅加不含细胞的新鲜完全培养液200μL,剩余孔添加PBS液200μL.培养24 h,含细胞孔更换新鲜H2O2浓度为5.0 mmol/L含药完全培养液(对叶百部总生物碱终浓度分别为 10,22,50,112和250μg/mL,维生素E终浓度为100μg/mL)[10],每孔添加200μL,模型组(仅加含H2O2新鲜完全培养液200μL)和空白孔(仅加新鲜完全培养液200μL),重复6个复孔.继续培养24 h,每孔添加5 mg/mL的MTT染液20μL,置培养箱正常培养4 h后,吸干孔中液体,每孔添加DMSO 100μL并置于酶标仪中37 ℃振荡10 min,在570 nm波长处检测吸光度(OD)值,并计算细胞存活率(%).

1.2.7 对叶百部总生物碱对H2O2所致V79细胞损伤细胞凋亡率的影响

取对数生长期V79细胞,调整细胞浓度至2×105个/mL,将无菌盖玻片放入6孔板内,每孔添加细胞混悬液1 mL,2×105个/孔.培养24 h,含细胞孔更换新鲜H2O2浓度为5.0 mmol/L含药完全培养液(对叶百部总生物碱终浓度分别为50μg/mL,112μg/mL和250μg/mL,维生素E终浓度为100μg/mL),每孔添加1 mL,模型组(仅加含H2O2新鲜完全培养液1 mL)和空白孔(仅加新鲜完全培养液1 mL),重复6个复孔.继续培养24 h,吸干孔中液体,每孔使用PBS液清洗2 mL清洗,重复3次,吸干孔中液体,每孔添加10%中性福尔马林液0.5 mL,15 min后,吸干孔中液体,每孔使用PBS液清洗2 mL清洗,重复3次,吸干孔中液体,每孔添加Hoechst 33258染色液0.5 mL,用锡箔纸包裹6孔板,15 min后,吸干孔中液体,每孔使用PBS液清洗2 mL清洗,重复3次,吸干孔中液体,取出盖玻片,晾干,使用PBS∶甘油=9∶1的抗荧光淬灭封片液封片,使用正置荧光显微镜每片连续计数1 000个细胞,记录1 000个细胞中凋亡细胞数目,计算凋亡率[11,12].凋亡率(%)= 100%×(凋亡细胞数目/1 000).

1.2.8 Annexin V-FITC/PI法检测对叶百部总生物碱对H2O2所致V79细胞损伤细胞凋亡率的影响

取对数生长期V79细胞,调整细胞浓度至2×105个/mL,接种于6孔板内,每孔添加细胞混悬液1 mL,2×105个/孔.培养24 h,含细胞孔更换新鲜H2O2浓度为5.0 mmol/L含药完全培养液(对叶百部总生物碱终浓度分别为50μg/mL,112μg/mL和250μg/mL,维生素E终浓度为100μg/mL),每孔添加1 mL,模型组(仅加含H2O2新鲜完全培养液1 mL)和空白孔(仅加新鲜完全培养液1 mL),重复3个复孔.继续培养24 h,吸干孔中液体,每孔使用PBS液清洗2 mL清洗,吸干孔中液体,每孔添加0.25%胰酶(不含EDTA)0.5 mL,观察细胞变钝变圆后,加入1 mL新鲜完全培养液终止消化,吹打收集细胞,2 000 r/min,离心5 min,用1 mLPBS液清洗细胞2次,收集细胞,添加500μL Binding Buffer悬浮细胞,再添加5μL Annexin V-FITC混匀,继续添加5μL Propidium Iodide轻轻混匀,室温、避光静置10 min,在1 h内完成流式细胞仪检测.

1.2.9 Western bolt法检测对叶百部总生物碱对H2O2所致V79细胞损伤细胞Bax、Bcl-2和Cleaved caspase-3蛋白表达

取对数生长期V79细胞,调整细胞浓度至1×106个/mL,接种于25 cm2培养瓶中,置于CO2培养箱培养至细胞生长汇合度达80%时,吸干瓶中液体,用2 mLPBS液清洗细胞1次,更换新鲜H2O2浓度为5.0 mmol/L含药完全培养液(对叶百部总生物碱终浓度分别为50μg/mL,112μg/mL和250μg/mL,维生素E终浓度为100μg/mL),每瓶添加5 mL,模型组(仅加含H2O2新鲜完全培养液5 mL)和空白孔(仅加新鲜完全培养液5 mL),重复3瓶.培养24 h,吸弃瓶中液体,PBS清洗3次,每瓶添加0.25%胰酶1 mL,观察细胞变钝变圆后,加入2 mL新鲜完全培养液终止消化,吹打收集细胞,2 000 r/min,离心5 min,用2 mLPBS液清洗细胞2次,收集细胞.加入500μL的RIPA裂解液,充分混匀,置于冰箱冷藏过夜后,置于低温高速离心机4 ℃,12 000 r/min离心10 min,取上清备用.测定蛋白水平后,加入4×蛋白上样缓冲液,混匀,95 ℃变性10 min,在50 v电压下使样品通过浓缩胶与分离胶分离,转膜,转移至PVDF膜上,将膜置于抗体Bax(1∶5 000),Bcl-2(1∶1 000),Cleaved caspase-3(1∶2 000)中,4 ℃反应过夜,TBST室温下避光洗膜3次,二抗(山羊抗鼠1∶3 000)孵育90 min,TBST清洗3次,将胶片扫描后,用image j软件测定条带灰度值,分析蛋白Bax、Bcl-2和Cleaved Caspase-3表达水平[13].

1.2.10 统计分析

2 结果与讨论

2.1 对叶百部总生物碱对V79细胞存活率的影响

表1显示,与空白组比较,对叶百部总生物碱250μg·mL-1及以下细胞暴露终浓度对V79细胞作用24 h后细胞存活率均无显著差异(P>0.05),说明对叶百部总生物碱250μg·mL-1及以下细胞暴露终浓度对V79细胞无明显毒性作用.

表1 对叶百部总生物碱对V79细胞存活率的 影响

2.2 H2O2对V79细胞存活率的影响

表2显示,与空白组比较,H2O20.5 ～ 8.0 mmol·L-1细胞暴露终浓度对V79细胞作用24 h后细胞存活率均显著降低(P<0.01),IC50为4.42±0.45 mmol·L-1,故后续试验采用H2O2细胞暴露终浓度为略大于IC50的5.0 mmol·L-1作为造模浓度.

表2 H2O2对V79细胞存活率的影响

2.3 对叶百部总生物碱对H2O2所致V79细胞损伤细胞存活率的影响

表3显示,经H2O2细胞暴露终浓度为5.0 mmol·L-1处理24 h后,与空白组比较,模型组V79细胞存活率显著降低(P<0.01),说明V79细胞氧化损伤模型造模成功.与模型组比较,对叶百部总生物碱各细胞暴露终浓度均可增加H2O2所致V79细胞损伤的细胞存活率,其中22～250μg·mL-1细胞暴露终浓度存活率显著增加(P<0.05,P<0.01),故后续试验采用细胞暴露终浓度50μg·mL-1、112μg·mL-1和250μg·mL-1.

表3 对叶百部总生物碱对H2O2所致V79细胞 损伤细胞存活率的影响

2.4 对叶百部总生物碱对H2O2所致V79细胞损伤细胞凋亡率的影响

图1、表4显示,空白组V79细胞核可见微弱淡蓝色荧光,偶见亮蓝色荧光细胞核; 与空白组比较,经H2O2细胞暴露终浓度为5.0 mmol·L-1处理24 h后,细胞核因染色质浓缩而呈亮蓝色染色的数目显著增多(P<0.01),凋亡率显著增加(P<0.01),染色质碎片状细胞核数目明显增多; 与模型组比较,对叶百部总生物碱(50、112、250μg·mL-1)干预V79细胞24 h后,H2O2诱导V79细胞凋亡作用显著减弱,细胞核呈亮蓝色染色的数目显著较少(P<0.01),凋亡率显著减少(P<0.01),细胞凋亡数目减少与细胞暴露终浓度呈正相关,浓度越大,细胞凋亡数目越少.

图1 对叶百部总生物碱对H2O2所致V79细胞损 伤凋亡形态的影响(Hoechst 33258染色法,×200)

表4 对叶百部总生物碱对H2O2所致V79细胞 损伤细胞凋亡率的影响

2.5 对叶百部总生物碱对H2O2所致V79细胞损伤细胞凋亡率的影响

图2、表5显示,经H2O2细胞暴露终浓度为5.0 mmol·L-1处理24 h后,与空白组比较,模型组V79细胞凋亡率显著增加(P<0.01);与模型组比较,对叶百部总生物碱细胞暴露终浓度50μg·mL-1、112μg·mL-1和250μg·mL-1均显著降低H2O2所致V79细胞损伤的细胞凋亡率(P<0.01),细胞凋亡率减少与细胞暴露终浓度呈正相关.

表5 对叶百部总生物碱对H2O2所致V79细胞 损伤细胞凋亡率的影响

图2 对叶百部总生物碱对H2O2所致V79细胞 损伤凋亡的影响(流式细胞术)

2.6 对叶百部总生物碱对H2O2所致V79细胞损伤相关凋亡蛋白表达的影响

图3和表6显示,经H2O2细胞暴露终浓度为5.0 mmol·L-1处理24 h后,与空白组比较,模型组V79细胞促凋亡蛋白Bax和Cleaved Caspase-3表达显著上调(P<0.01),抑凋亡蛋白Bcl-2表达下调(P<0.05); 与模型组比较,对叶百部总生物碱各剂量组V79细胞促凋亡蛋白Bax和Cleaved Caspase-3表达均下调,其中112μg·mL-1和250μg·mL-1剂量组差异具有显著性(P<0.05),抑凋亡蛋白Bcl2表达均显著上调(P<0.05或P<0.01).

图3 对叶百部总生物碱对H2O2所致V79细胞 损伤相关凋亡蛋白表达的影响

表6 对叶百部总生物碱对H2O2所致V79细胞 损伤细胞凋亡率的影响

3 结论

在肺部炎症疾病发生发展过程中,氧化应激损伤是重要的发病机制.细胞凋亡在健康机体内属于基因控制细胞具有自主性的死亡方式,但当机体氧化和抗氧化失衡,特别是氧化自由基的大量堆积,就会导致肺细胞线粒体损伤,激活caspase家族,如Cleaved Caspase-3、caspase-9和caspase-3等,促进肺细胞凋亡[14，15].Bax是促凋亡蛋白,其在凋亡早期可易位至线粒体外膜,增加外膜通透性,激活caspase家族,促进细胞凋亡; 而Bcl-2是抑凋亡蛋白,其能够调节线粒体外膜完整性和功能,抑制凋亡死亡程序,调整凋亡的稳态平衡[14].Bax和Bcl-2在机体内的比例,决定细胞的存活和凋亡,是评价药物抑制细胞凋亡或促进细胞凋亡的重要指标[16，17].有研究表明,对叶百部及其生物碱类成分有镇咳、抗肺纤维化作用等作用[6-8,18],而氧化应激损伤是特发性肺纤维化的主要危险因素[2],故认为增强机体抗氧化能力可能是对叶百部总生物碱拮抗肺纤维化的重要机制.

氧化应激损伤诱发细胞线粒体功能失调,释放活性氧化自由基(ROS),如超氧阴离子·O2-、过氧化氢(H2O2)和羟自由基(·OH)等,上调Bcl-2家族促凋亡蛋白表达,可使线粒体功能发生障碍促凋亡蛋白Caspase-3表达上调,Bcl-2家族是细胞凋亡和肺纤维化发展的重要调节因子[3,14,15].Bax和Bcl-2均是凋亡关键蛋白，是评价组织损伤程度的关键指标[19].H2O2是机体ROS之一,也是体外试验多种细胞氧化应激损伤的常用诱导剂,可直接导致细胞膜脂质和蛋白质变性,还可透过细胞膜与还原型铁离子通过Fenton反应结合成活性更强的羟自由基,诱导细胞凋亡或坏死[20-22].Hoechst 33258 染色法是一种染色细胞核DNA，用于检测细胞死亡是否与凋亡有关的方法.活细胞细胞核被染成淡蓝色呈微弱荧光，凋亡细胞细胞核被染成亮蓝色呈强荧光染色，死亡不被染色[23].

本研究表明,H2O2作用于V79细胞24 h后,可使其细胞存活率显著降低,凋亡形态观察和流式细胞术结果表明,细胞核染色质浓缩呈亮蓝色染色的数目显著增多,凋亡率显著增加,促凋亡蛋白Bax和Cleaved Caspase-3表达显著上调,抑凋亡蛋白Bcl-2表达显著下调,表明H2O2建立的V79细胞氧化应激凋亡模型成功.

对叶百部总生物碱对V79细胞作用24 h后无明显毒性,其可显著增加H2O2所致V79细胞损伤细胞存活率,显著减少凋亡率,下调促凋亡蛋白Bax和Cleaved Caspase-3表达,上调抑凋亡蛋白Bcl-2表达,说明对叶百部总生物碱有很好的拮抗H2O2所致V79细胞损伤细胞,抑制其过度凋亡,其机制可能与促进抑凋亡蛋白Bcl-2表达和抑制促凋亡蛋白Bax、Cleaved Caspase-3表达有关,有良好的抗击肺炎的前景,可能是多种生物碱综合作用的结果,具体某种生物碱发挥更强作用及强度尚不明确,有待于进一步研究发现.