郑 颖， 钟 宇， 陈永华， 付广义

(1.中南林业科技大学 环境科学与工程学院， 湖南 长沙 410004； 2.湖南省环境保护科学研究院 水污染控制技术湖南省重点实验室, 湖南 长沙 410014)

0 引言

随着水产品市场需求的持续增长，为追求经济效益，养殖户开始大规模实施高密度、高投入、高产出的养殖方式，大量未消纳的饲料和鱼虾粪未经处理便随养殖尾水直接排放至自然环境，使得水体中各污染物浓度增大，环境水质显著下降[1].研究表明，水产养殖尾水中主要污染物包括氮磷及污损生物等[2].

光合细菌是一种原核生物，可有效促进元素循环[3].在处理实际水产养殖废水中添加光合细菌可有效改善养殖水质，并提高水产品幼体成活率[4-6].现有研究表明，光合细菌混合菌比其单株菌具有更高的产氢率和更好的稳定性[7]，且混合菌能更适应实际水体的环境变化[8].因此，培养高活性光合细菌混合菌处理水产养殖尾水具有更大的实际应用意义.

本课题筛选了光合细菌混合菌群，通过高通量测序技术鉴定不同驯化培养阶段混合菌群的多样性变化，确定混合菌种类、丰度和不同细菌间的相互作用关系；利用CS和SA作为复合物包埋菌群，进行优化实验，考察不同因素条件下固定化菌群对水产养殖尾水中氮磷降解效率的影响.研究结果为光合细菌混合菌的筛选和包埋技术应用提供了基础.

1 实验部分

1.1 实验材料

光合细菌混合菌：光合细菌混合菌是实验室从长沙圭塘河泥水中取得样品，经富集、扩大培养得来，并将混合菌命名为MPB1.

MPB1混合菌富集培养基为：乙酸钠2.5 g/L，酵母膏0.2 g/L，MgSO40.5 g/L，NH4Cl 1.0 g/L，KH2PO40.5 g/L，NaHCO31.0 g/L，微量元素溶液10 mL，pH 7.0.在121 ℃下灭菌20 min.

MPB1混合菌扩大培养基为：乙酸钠2.5 g/L，黄腐酸0.2 g/L，酵母膏0.4 g/L，MgSO40.5 g/L，NH4Cl 1.0 g/L，KH2PO40.5 g/L，NaHCO31.0 g/L，微量元素溶液10 mL，pH 7.0.在121 ℃下灭菌20 min.

1.2 实验方法

1.2.1 光合细菌混合菌的驯化培养

取采集的泥水50 mL于100 mL容量瓶中，加入富集培养基至瓶口处，盖塞，封口膜封口.在光照强度5 000 lx、30 ℃条件下培养3天，富集培养3次，将3次富集培养阶段命名为R1、R2、R3.此时，混合菌培养液呈鲜红色，代表光合细菌为优势菌，此菌液可作为扩大培养的菌种.

在100 mL容量瓶中接种10 mL对数生长期后期的菌液，加入扩大培养基至瓶口处，盖塞，封口膜封口.在富集培养相同条件下培养7天，扩大培养3次，将3次扩大培养阶段命名为R4、R5、R6.此时，混合菌培养液呈深红色，可作为后续实验的接种液[20-21].

1.2.2 DNA抽取和高通量测序

选取不同驯化培养阶段(R1、R2、R3、R4、R5、R6)的样品菌液进行离心.根据E.Z.N.A.® soil DNA kit (Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.)说明书进行微生物群落总DNA抽提，使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量，使用NanoDrop2000测定DNA浓度和纯度；使用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)对16S rRNA基因V3-V4可变区进行PCR扩增.将同一样本的PCR产物混合后使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，对回收产物进行检测定量，利用Illumina公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250平台进行测序(上海美吉生物医药科技有限公司).

1.2.3 固定化包埋材料比选实验

1.2.4 固定混合菌最佳包埋条件

通过参考王建龙等[25]的生物固定化颗粒的制备方法，设置CS质量分数、SA质量分数和交联时间为因素条件，通过不同因素条件对模拟尾水净化效果的影响，确定最优包埋条件.3因素3水平正交实验如表1所示.

表1 固定化实验3因素3水平

1.2.5 固定化球粒净化效果的影响因素实验

设置不同光照条件：光照24 h、光暗比12 h∶12 h和黑暗24 h，观察不同光照条件下对固定化球粒净化效果的影响，选择最佳光照时间；设置不同固定化球粒投加量：20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L和70 g/L，分析不同投加量的净化效果，确定最佳投加量.

1.2.6 分析方法

2 结果与讨论

2.1 不同驯化培养阶段菌群丰富度、多样性及聚类分析

对不同驯化培养阶段的MPB1菌群进行高通量测序，样品共获得263 624条16S rDNA基因片段优化序列.在97%的相似度下，共有175个OTUs，覆盖度高于99.9%，表示样品具有代表性.菌群丰富度指数(Ace指数)如图1所示，R4-R6驯化培养时期的Ace指数无明显变化，说明驯化培养阶段菌群丰富度逐渐稳定.

图1 不同驯化培养阶段下的Ace指数

MPB1菌群在属分类学水平的层级聚类和PCA分析[27]如图2(a)、(b)所示，菌群群落结构随着驯化阶段的变化在层级聚类中逐渐具有相似性；PCA分析图展示不同驯化培养阶段，菌群间的距离开始靠近，同样反映了群落结构相似性慢慢增大.分析结果表明培养后期阶段菌群结构趋于稳定，再进行驯化培养对其群落结构影响较小，说明菌群培养成熟，可进行净化效果实验.

图2 不同驯化培养阶段菌群在属分类水平下的 层级聚类和PCA分析

2.2 不同驯化培养阶段菌群群落组成

图3 不同驯化培养阶段下微生物群落组成

2.3 群落的相互作用分析

有效净化自然环境中的污染物，依赖于混合菌群中多种微生物之间的共同作用[30-31].根据Spearman相关系数，构建菌群中不同菌属之间的相关关系网络图，用于探究反应菌群中微生物间的相互作用[32].MPB1菌群中优势菌属间的相互作用网络图如图4所示，互养菌属(Synergistaceae)、脱硫弧菌属(Desulfobibrio)、梭菌属(Clostridium)和红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)，各菌属间拥有正相关关系，表示在混合菌生物净化过程中，菌属间的主要关系可能为协同作用，通过协同作用加强了水质净化能力.

图4 菌群微生物间相互作用网络图

2.4 不同固定化包埋材料比选实验

不同包埋材料固定MPB1菌群对TP去除效率的影响如图5(c)、(d)显示，TP处理效果最佳的组为CS固定化球粒组，去除效率达到74.2%，其次是CS-SA固定化球粒组，去除效率为57.8%.对照组的CS、CS-SA空白球粒组对TP的吸附效率分别为62.5%和47.7%.通过与对照组的对比说明，包埋材料吸附功能在降低TP含量过程中发挥主要作用，其中CS包埋材料拥有对TP最佳吸附效果.

不同包埋材料固定MPB1菌群对TN去除效率的影响如图5(e)、(f)显示，CS-SA固定化球粒组对TN去除效率为71.4%，是最佳处理组.对照组的最佳处理组是空白SA固定化组，吸附效率为46.5%.通过对比分析得出，MPB1菌群与CS-SA包埋材料能拥有最佳协同作用，使得其处理效果最佳.因此，通过综合比较选择CS-SA作为包埋材料进行后续实验.

图5 不同载体空白球粒和不同载体球粒组对 和TN的去除效果影响

2.5 复合物固定化菌群最佳包埋条件

表2 正交试验数据分析结果

2.6 不同光暗比对净化效果的影响

图6 不同光暗比对固定化球粒降解 和TN的效果分析

2.7 不同投加量对净化效果的影响

不同投加量对固定化球粒去除效果的影响如图7所示，投加量在20～40 g/L范围时，污染物去除效率随着投加量的增多而上升.

图7 不同球粒投加量对固定化球粒去除 和TN的效果分析

3 结论

(2)MPB1菌群中红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)相对丰度最大.Spearman相关系数分析显示，菌群中互养菌属(Synergistaceae)、脱硫弧菌属(Desulfobibrio)、梭菌属(Clostridium)和红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)，各菌属间拥有相互作用关系，可能是菌属间的协同关系提高了微生物的合成代谢效率，强化了混合菌的生物净化能力.