李刚 张达 张建秀

宫颈癌是威胁女性健康的第二大癌症，放射及化学治疗的不良反应较大，中药有效成分在抗肿瘤方面有着多途径、多靶点、毒副作用小等优势，一定程度上可延长宫颈癌患者的生存期[1,2]。因此，开发可用于抗宫颈癌中药对其治疗具有重要意义。槐定碱是从豆科槐属植物苦豆子(sophora alopecuroides L)中提取的单体生物碱，具有显著的抗肿瘤作用，是一种高效低毒的抗癌生物碱；有研究报道槐定碱联合顺铂可以有效抑制卵巢癌细胞增殖，降低其恶性程度[3]。槐定碱可抑制肝癌SMMC-7721细胞增殖和促进凋亡[4]。槐定碱可抑制肺癌A549细胞体外增殖和侵袭能力[5]。槐定碱通过靶向MAPKAPK2促进细胞自噬、凋亡和周期阻滞，从而抑制结直肠癌的发生与发展[6]。然而槐定碱对宫颈癌HeLa细胞生物学行为的影响及机制尚不清楚。有研究报道miR-5195-3p可能通过阻碍EMT通路抑制宫颈癌细胞SiHa的增殖，迁移与侵袭[7]。miR-5195-3p对神经胶质瘤细胞亦具有增殖抑制作用[8]。因此，本实验旨在探讨槐定碱对宫颈癌HeLa细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制是否与miR-5195-3p有关。

1 材料与方法

1.1 材料 宫颈癌细胞株HeLa(上海冠导生物工程有限公司)；RPMI-1640培养基(浙江联硕生物科技有限公司)；槐定碱(纯度≥98%，江苏永健医药科技有限公司)；MTT试剂盒(大连美仑生物公司)；吉萨姆染色液(上海钰博生物科技有限公司)；Transwell小室、基质胶(美国康宁)；RIPA蛋白裂解液(上海北诺生物科技有限公司)；山羊抗兔IgG-HRP(美国GeneCopoeia)；E-cadherin抗体、N-cadherin抗体(武汉菲恩生物科技有限公司)；Trizol试剂、荧光定量PCR试剂盒(日本Takara)。

1.2 细胞处理与分组 宫颈癌细胞株HeLa常规培养于RPMI-1640培养基中，取对数生长期细胞，分别用浓度为1.25 g/L、2.5 g/L、5 g/L的槐定碱处理，作为槐定碱低、中、高浓度组，常规培养的细胞作为对照组；将miR-5195-3p模拟物及阴性对照转染至HeLa细胞，记为miR-5195-3p组、miR-NC组；将miR-5195-3p抑制剂及阴性对照转染至HeLa细胞后用5 g/L的槐定碱处理，记为槐定碱+anti-miR-5195-3p组、槐定碱+anti-miR-NC组。

1.3 MTT法检测细胞增殖抑制率 各组细胞培养48 h按照20 μl/孔加入MTT溶液，孵育4 h后去上清，按照150 μl/孔加入二甲基亚砜，振荡反应10 min，酶标仪测量490 nm处吸光度(OD)值。细胞增殖抑制率(%)=(1-试验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.4 克隆形成实验检测细胞克隆形成数 各组细胞制成1×104个/ml细胞悬液，取100个细胞接种6孔板，适时更换培养液，当出现肉眼可见克隆时终止培养，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次，经甲醇固定、吉姆萨染色后，显微镜下计数>50个细胞的克隆数。

1.5 划痕实验检测细胞划痕愈合率 各组细胞消化后接种于培养板，过夜细胞铺满后用枪头直线划痕，用PBS冲洗划下的细胞，换液后继续培养，在培养0 h和24 h拍照观察，用Image-Pro Plus 6.0软件计算划痕愈合率。

1.6 Transwell小室法检测细胞侵袭 将稀释好的基质胶包被Transwell小室上室膜，凝固后接种100 μl细胞悬液，下室加500 μl含血清培养液，37℃培养24 h，棉签擦拭掉上层未穿过基底膜的细胞，用0.1%结晶紫染色细胞30 min，PBS漂洗2遍，风干后光学显微镜(×200)下随机选择5个视野，观察并计数。

1.7 Western blot法检测蛋白表达 提取各组细胞总蛋白，煮沸5 min使蛋白变性，按照40 μg上样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后湿转到NC膜，用封闭液封闭1 h，分别加入E-cadherin、N-cadherin抗体(1∶1 000)，4℃孵育过夜；洗膜，加入山羊抗兔IgG-HRP(1∶2 000)室温孵育2 h，洗膜后显影，用ChemiDoc XRS+系统成像，Quantity One软件分析蛋白条带灰度值，计算蛋白相对表达水平。

1.8 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-5195-3p表达水平 提取细胞总RNA，按荧光定量PCR试剂盒配置反应体系，以U6为内参进行PCR扩增，相对表达量采用2-△△Ct法计算。miR-5195-3p上游引物序列：5’-GCCTGTAGGCATCATCGCCAG-3’，下游引物序列：5’-GATAGAGTGACGTGAAGTAG-3’；U6上游引物序列：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列：5’-CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT-3’。

2 结果

2.1 槐定碱对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响 与对照组比较，槐定碱低、中、高浓度组HeLa细胞增殖抑制率升高，细胞克隆形成数减少，呈浓度依赖性(P<0.05)。见表1。

表1 槐定碱对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响

2.2 槐定碱对宫颈癌HeLa细胞迁移侵袭的影响 与对照组比较，槐定碱低、中、高浓度组HeLa细胞划痕愈合率、侵袭细胞数、N-cadherin蛋白表达降低，E-cadherin蛋白表达升高，呈浓度依赖性(P<0.05)。见表2，图1。

图1 槐定碱对宫颈癌HeLa细胞迁移侵袭相关蛋白表达的影响

表2 槐定碱对宫颈癌HeLa细胞迁移侵袭的影响

2.3 槐定碱对宫颈癌HeLa细胞miR-5195-3p表达的影响 与对照组比较，槐定碱低、中、高浓度组miR-5195-3p表达水平升高，呈浓度依赖性(P<0.05)。见表3。

表3 槐定碱对宫颈癌HeLa细胞miR-5195-3p表达的影响

2.4 过表达miR-5195-3p对宫颈癌HeLa细胞增殖、迁移和侵袭的影响 与miR-NC组比较，miR-5195-3p组miR-5195-3p表达水平、增殖抑制率、E-cadherin蛋白表达升高，划痕愈合率、克隆形成数、侵袭细胞数、N-cadherin蛋白表达降低(P<0.05)。见图2，表4。

图2 过表达miR-5195-3p对宫颈癌HeLa细胞迁移侵袭相关蛋白表达的影响

表4 过表达miR-5195-3p对宫颈癌HeLa细胞增殖、迁移和侵袭的影响

2.5 干扰miR-5195-3p表达逆转了槐定碱(5 g/L)对宫颈癌HeLa细胞增殖、迁移和侵袭的作用 与槐定碱+anti-miR-NC组比较，槐定碱+anti-miR-5195-3p组miR-5195-3p表达水平、增殖抑制率、E-cadherin蛋白表达降低，划痕愈合率、克隆形成数、侵袭细胞数、N-cadherin蛋白表达升高(P<0.05)。见表5，图3。

表5 干扰miR-5195-3p表达逆转了槐定碱对宫颈癌HeLa细胞增殖、迁移和侵袭的作用

图3 干扰miR-5195-3p表达逆转了槐定碱对宫颈癌HeLa细胞迁移侵袭相关蛋白表达的作用

3 讨论

中药具有良好的抗肿瘤活性，中药生物碱类成分是近年来研究的热点，在治疗恶性肿瘤方面有着较大的优势[9]。槐定碱是生物碱的一种，研究报道槐定碱通过激活P53和Hippo信号通路抑制肺癌细胞生长并增强顺铂敏感性[10]。槐定碱能显著抑制人胶质瘤U87MG细胞、胰腺癌细胞capan-1增殖，诱导细胞凋亡[11,12]。槐定碱可能通过下调HMGB3抑制人胃癌MKN45细胞的增殖，促进其凋亡[13]。为研究槐定碱对宫颈癌HeLa细胞的影响，本实验用不同浓度槐定碱处理HeLa细胞，结果显示，HeLa细胞增殖抑制率、E-cadherin蛋白表达升高，细胞克隆形成数、划痕愈合率、侵袭细胞数、N-cadherin蛋白表达降低，呈浓度依赖性；表明槐定碱可浓度依赖性的抑制HeLa细胞增殖、迁移和侵袭。

有研究报道miR-5195-3p通过直接靶向骨肉瘤中的NEDD9抑制细胞增殖并诱导凋亡[14]。miR-5195-3p的上调抑制了非小细胞肺癌细胞的增殖，迁移和侵袭[15]。miR-5195-3p通过直接靶向癌基因KLF5抑制人膀胱癌细胞的增殖和侵袭[16]。本实验结果显示，过表达miR-5195-3p后，HeLa细胞增殖抑制率、E-cadherin蛋白表达升高，划痕愈合率、N-cadherin蛋白表达降低，细胞克隆形成数和侵袭细胞数减少；表明miR-5195-3p对HeLa细胞生物学行为具有抑制作用。槐定碱还可提高miR-5195-3p表达水平；而干扰miR-5195-3p表达逆转了槐定碱对HeLa细胞增殖、迁移和侵袭的作用。

综上所述，槐定碱可能通过上调miR-5195-3p表达来抑制宫颈癌HeLa细胞增殖、迁移和侵袭。