王洪涛 梁育芩 李海峰

胃癌为最常见的癌症，是全世界癌症相关死亡率的排名第二的诱因，也是东亚最常见的癌症[1,2]。全世界每年约有99万人被诊断出患有胃癌，其中约73.8万人死于该疾病，使胃癌成为第四大常见癌症，胃癌也是导致患者负担最高的癌症之一[3]。肿瘤细胞通过糖酵解而不是氧化磷酸化以获得能量是肿瘤细胞的特征。这种代谢现象被称为有氧糖酵解或“Warburg效应”。肿瘤细胞中增加的葡萄糖消耗、增加的糖酵解活性和乳酸的积累是肿瘤细胞的重要特征[4]。与主要通过线粒体氧化磷酸化产生能量的正常细胞相比，即使在有氧条件下，肿瘤细胞也主要通过增加糖酵解获得能量。乳酸的积累形成酸性微环境，对肿瘤细胞有保护作用[5]。此外在过去30年中，越来越多的证据表明谷氨酰胺是许多肿瘤细胞的重要代谢底物和能量来源，这些肿瘤细胞需要谷氨酰胺才能持续生长和存活，表现出所谓的“谷氨酰胺成瘾”。谷氨酰胺代谢不仅为肿瘤细胞提高能量，同时为其提供细胞增殖的原料[6]。马尾连为毛茛科唐松草属植物多叶唐松草Thalictrum foliolosum DC的根茎，该药具有清热燥湿，泻火解毒的作用，用于肠炎、痢疾、黄疸、目赤肿痛，生物碱是其主要活性成分，近年研究发现马尾连提取物及其生物总碱对小鼠肺癌的抑制率达74%，对腹水淋巴瘤小鼠生命延长率为137.2%[7,8]，研究发现马尾连生物碱主要为甲、乙、丙三类，其中马尾连生物碱甲可阻断G1细胞向S期过渡,其杀细胞作用似为细胞周期特异性，生物碱乙及丙也具有一定的抗肿瘤作用[9,10]，笔者总结后发现研究较少有待进一步明确其作用。本研究拟探讨马尾连碱乙在胃癌中的作用及其对胃癌细胞能量代谢的影响，报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料与主要仪器 人胃癌SGC-7901、BGC-823 细胞系购自中国科学院上海细胞研究所，马尾连碱乙(SIGMA，美国)，四甲基偶氮唑盐(MTT,95%，SIGMA 公司美国)；二甲基亚砜(DMSO，百灵威试剂公司)；乳酸含量试剂盒，葡萄糖试剂盒(Bivision公司，英国)，ATP检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，A095-1-1，中国)，谷氨酰胺试剂盒(南京建成生物工程研究所，A047-1-1，中国)，实验其他试剂均为化学纯。主要仪器为蛋白印迹系统(Bio-rad公司,美国)，多功能酶标仪(sigma公司，美国)。

1.2 方法

1.2.1 正常细胞模型:采用人胃癌SGC-7901，BGC-823细胞，将不同细胞系37℃条件下，采用含有10%小牛血清培养基培养于二氧化碳培养箱，培养基为采用85 U/L青霉素、100 mg/L 链霉素的DMEM。将细胞接种于96孔板中，设立复孔，分为4组，空白组细胞正常培养基培养，马尾连碱乙组(浓度为5 μmol/L、25 μmol/L、75 μmol/L)。采用MTT法观察马尾连碱乙对胃癌细胞活力，迁移，侵袭能力的影响。

1.2.2 谷氨酰胺剥夺细胞模型:建立谷氨酰胺剥夺细胞模型，去除正常DMEM，用PBS一次性冲洗或转染正常细胞。添加不含谷氨酰胺的DMEM(Thermo Fisher Science，A14431)。此外，向培养基中添加10%的DFBS(美国加利福尼亚州萨克拉门托,Gemini Bio Products)。细胞在此培养基中培养24 h。细胞适应培养基后，正常传代，继续使用。

1.3 MTT抑制率实验 将不同的胃癌细胞SGC-7901，BGC-823分别接种在96孔板中，浓度为1×105个细胞，24 h 后加入含有马尾连碱乙的培养液继续培育,每组6孔。12 h、24 h、48 h后，加入30 μl MTT继续在培养箱中孵育4 h,加入150 μl DMSO溶解结晶物。采用酶标仪在550 nm下检测吸光度(A)值，计算细胞活力。

1.4 三磷酸腺苷(ATP)及谷氨酰胺含量实验 采用ATP及谷氨酰胺试剂盒检测细胞培养基中的乳酸含量，将不同的胃癌细胞SGC-7901、BGC-823分别接种在6孔板中，浓度6×107个细胞，24 h后加入含有马尾连碱乙的培养液继续培育24 h后检测,每组3孔。ATP及谷氨酰胺检测方法按照试剂盒说明书进行。

1.5 葡萄糖消耗及乳酸含量实验 采用葡萄糖及乳酸试剂盒检测细胞培养基中的乳酸含量，将不同的胃癌细胞SGC-7901、BGC-823分别接种在6孔板中，浓度6×107个细胞，24 h 后加入含有马尾连碱乙的培养液继续培育24 h后检测,每组3孔。葡萄糖及乳酸试剂盒检测方法按照试剂盒说明书进行。

1.6 细胞迁移实验 置于24孔板中浸泡1 h，将不同的胃癌细胞SGC-7901、BGC-823于对数生长期消化，计数制备细胞悬液，加入24孔板中，每孔加入100 μl细胞悬液，24孔板中加入Transwell，加入药物干预，37℃孵育24 h，取出Transwell，用PBS洗涤2次，用0.4%多聚甲醛在4℃固定30 min，用PBS洗涤2次，室温下用0.1%结晶紫染色15～30 min，用PBS洗涤2次，显微镜下观察计数。

1.7 细胞侵袭实验 用无血清培养基将基质凝胶稀释至最终浓度1 mg/ml。在Transwell培养箱中，向上培养箱中加入100 μl基质凝胶，在37℃下培养4～5 h，使其凝胶化。在上腔分别加入的胃癌细胞。下室加入含血清培养基600 μl，孵育2 h后取出培养箱，甲醇固定30 min，Giemsa染色30 min，随机抽取9个视野进行显微镜下计数。

1.8 蛋白免疫印迹实验 分别将胃癌细胞SGC-7901和BGC-823接种于6孔板中，浓度为5×106个细胞，给药干预24 h后，提取细胞蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度。加入50 ng样品蛋白，电泳分离后，用湿转移印花法将蛋白转移到PVDF膜上，用含1%脱脂奶粉和0.1%TBST的TBS密封过夜，TBST洗涤3次，每次5 min，加入一抗体，4℃孵育过夜，TBST洗涤3次，每次5 min。加入辣根过氧化物酶(1∶2 000)标记的二抗体，室温孵育2 h，TBST洗涤膜，每次5 min。以GAPDH为内参照。用ECL化学发光试剂显色。

2 结果

2.1 马尾连碱乙显著抑制胃癌细胞活力 给予中、高剂量马尾连碱乙干预后，SGC-7901细胞在干预24 h及48 h后细胞活力与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，中剂量马尾连碱乙干预BGC-823细胞48 h后，细胞活力与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，高剂量马尾连碱乙干预24 h后，两种胃癌细胞活力与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 马尾连碱乙对胃癌细胞活力的影响

2.2 马尾连碱乙抑制胃癌细胞的迁移及侵袭能力 给予马尾连碱乙后，细胞迁移及侵袭能力增加，细胞穿膜数量明显增加，其中SGC-7901细胞中，给予中、高剂量的马尾连碱乙干预后，迁移及侵袭细胞穿膜数与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。BGC-823细胞给予中、高剂量马尾连碱乙干预后，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，高剂量组干预后，迁移及侵袭细胞穿膜数与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 马尾连碱乙对胃癌细胞迁移和侵袭实验中的穿膜细胞数的影响 n=3,个,

2.3 马尾连碱乙显著抑制胃癌细胞能量代谢水平及谷氨酰胺含量 给予马尾连碱乙后，马尾连碱乙可以明显抑制细胞的能量代谢水平，在SGC-7901细胞中，马尾连碱乙中、高浓度均可以显著抑制细胞能量代谢水平，同时显著抑制细胞中谷氨酰胺含量，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；在BGC-823细胞中，给予马尾连碱乙干预后，细胞能量代谢水平明显减低，中、高剂量组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，中、高剂量组干预后，均可以抑制BGC-823细胞中的谷氨酰胺含量，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 马尾连碱乙对胃癌细胞ATP及谷氨酰胺含量的影响

2.4 马尾连碱乙对胃癌细胞糖酵解水平的影响 给予马尾连碱乙干预后，对两种胃癌肿瘤细胞的乳酸含量及葡萄糖消耗水平具有一定的影响，但与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 马尾连碱乙对胃癌细胞糖酵解水平的影响

2.5 马尾连碱乙抑制胃癌细胞谷氨酰胺酶的表达 蛋白实验结果表明，马尾连碱乙对SGC-7901、BGC-823胃癌肿瘤细胞谷氨酰胺酶表达均具有明显的抑制作用，且随计量的升高作用更加显著。见图1。

图1 马尾连碱乙在不同细胞中抑制胃癌细胞谷氨酰胺酶的表达

2.6 马尾连碱乙在无谷氨酰胺环境下对胃癌细胞活力抑制作用 将两种不同的胃癌细胞接种于无谷氨酰胺的培养基中，实验结果表明，马尾连碱乙对细胞活力的抑制作用显著降低，其中仅在高剂量组对SGC-7901在干预48 h后，具有一定抑制作用，且差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 马尾连碱乙在无谷氨酰胺环境下对胃癌细胞活力的影响

2.7 马尾连碱乙在无谷氨酰胺环境下对胃癌细胞迁移及侵袭能力的影响 将两种不同的胃癌细胞接种于无谷氨酰胺的培养基中，实验结果表明，马尾连碱乙对细胞的迁移及侵袭能力影响作用显著降低，其中在高剂量组对SGC-7901的迁移实验具有抑制作用，差异有统计学意义(P<0.05)。见表6。

表6 在无谷氨酰胺环境下马尾连碱乙对胃癌细胞迁移和侵袭的穿膜细胞数的影响 n=3,个,

2.8 马尾连碱乙在无谷氨酰胺环境下对胃癌细胞ATP含量的影响 将两种不同的胃癌细胞接种于无谷氨酰胺的培养基中，实验结果表明，马尾连碱乙对细胞的能量代谢水平无显著影响，不同浓度的马尾连碱乙干预后，细胞的能量代谢水平与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表7。

表7 在无谷氨酰胺环境下马尾连碱乙对胃癌细胞ATP含量的影响

3 讨论

胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一。外科手术目前被认为是唯一的根治性治疗。随着手术技术的进步和传统放疗、化疗及新辅助治疗的实施，早期胃癌的5年生存率可达95%以上[1]。然而，早期诊断率低意味着大多数患者在诊断时都有晚期疾病，因此错过了最佳手术窗口。因此辅助放化疗、分子靶向治疗和免疫治疗是晚期胃癌的主要治疗方法。

癌细胞的新陈代谢与正常细胞有很大的不同。糖酵解和谷氨酰胺分解途径在癌细胞中的能量供应中均显著增强。当糖酵解增强以满足癌细胞不断增加的能量需求时，谷氨酰胺分解增强以提供癌细胞的生物合成前体[11]。

本研究发现马尾连碱乙可以显著抑制胃癌细胞的增殖活力，同时降低胃癌细胞的迁移及侵袭能力，给予马尾连碱乙可以明显降低胃癌细胞ATP合成能力，但其不影响细胞乳酸及葡萄糖消耗水平。糖酵解是肿瘤细胞能量代谢的主要来源，而谷氨酰胺同样参与肿瘤细胞的的能量代谢，谷氨酰胺是一种丰富的多功能营养素，参与癌细胞的能量形成、氧化还原稳态、大分子合成和信号传导。谷氨酰胺作为营养素在癌症中的重要性源于它可以将氮和碳提供给肿瘤促进肿瘤细胞增殖[12,13]。谷氨酰胺是血浆中最丰富的氨基酸之一。尽管大多数组织可以合成谷氨酰胺，但在快速生长或其他应激期间，谷氨酰胺成为肿瘤细胞快速增殖的关键因素[14,15]。

本研究发现马尾连碱乙随对糖酵解反应没有显著干预作用，但可显著抑制胃癌细胞谷氨酰胺代谢能力，降低肿瘤细胞中的谷氨酰胺含量。体内循环的谷氨酰胺通过转运蛋白如SLC1A5进入细胞。癌细胞通过谷氨酰胺酶介导的谷氨酰胺分解将谷氨酰胺转化为谷氨酸，可被谷氨酸脱氢酶(GLUD)或谷氨酸转氨酶进一步脱氨基为α-酮戊二酸(α-KG)，进入三羧酸(TCA)循环，α-酮戊二酸是TCA循环的中间产物，也是修饰蛋白质和DNA的双加氧酶的底物。近年研究发现，沉默GLS表达或抑制GLS活性可以明显延缓肿瘤生长[16-18]。有研究发现GLS2是p53靶基因，在肿瘤抑制中起发挥作用。近期的研究发现上皮细胞-细胞粘附分子E-cadherin参与肿瘤细胞诱导迁移、侵袭，其机制与谷氨酰胺代谢相关[19,20]。

本研究发现马尾连碱乙可以显著抑制谷氨酰胺酶的表达，当将马尾连碱乙给予缺乏谷氨酰胺培养基的胃癌细胞后其对肿瘤细胞的调节能力消失，其对肿瘤细胞的抑制作用显著降低，同时其对细胞迁移，侵袭的能力显著降低。

综上所述，马尾连碱乙可以抑制谷氨酰胺酸的表达，影响胃癌细胞谷氨酰胺代谢，抑制其能量代谢水平，从而发挥抑制胃癌细胞增殖活力及减少迁移及侵袭的作用，但其具体的调控分子机制还有待于进一步的研究。