陈燕南，范 成，张 锋，朱朝东，陈 军*

(1. 中国科学院动物研究所动物进化与系统学院重点实验室，北京 100101；2. 河北大学生命科学学院动物系统学与应用重点实验室，河北保定 071002；3. 中国科学院大学，北京 100049)

甲螨(oribatid mites)隶属于节肢动物门Arthropoda蛛形纲Arachnida蜱螨亚纲Acari疥螨目Sarcoptiformes甲螨亚目Oribatida，其体型微小(体长多为0.1～1 mm)，形态结构复杂，种类众多，目前世界上已经发现并记录的甲螨达11 000种以上，估计实际种数超过50万种(Norton and Behan-Pelletier, 2009)。甲螨多栖息于土壤腐殖质中，主要为菌食性和腐食性，在土壤腐殖质的分解过程中发挥着重要作用，是一类重要的土壤动物。

由于甲螨种类众多、个体微小，某些种类形态结构还存在种内变异现象，因而仅仅依靠其形态特征有时难以准确鉴定物种和分析其系统发育关系(Navajas and Fenton, 2000)。20世纪分子生物学的革命性变化，尤其是在80年代中期聚合酶链式反应技术和DNA测序技术的产生，促进了分子生物学在物种鉴定与进化研究方面的应用(Cruickshank, 2010)。进入21世纪以来，分子分类技术(Tautzetal., 2003)和DNA条形码技术(Hebertetal., 2003a)等新研究手段更是极大地推动了分子分类学在生物多样性研究中的广泛应用。在进行上述相关研究时，往往首先需要提取生物的DNA。但是，由于体型微小，体壁高度硬化，从甲螨个体提取DNA而又不损伤其外部形态结构特征非常困难，从而使得分子分类学在甲螨多样性研究中尚未得到很好应用。

在其它螨类研究中，往往可以从同一物种中挑选出多个个体，将这些个体彻底粉碎研磨然后进行DNA提取，便可获得足够的DNA。但这种方法应用在甲螨研究中面临着极大的障碍：甲螨物种众多，从一号土样中分离出的甲螨一般不止一种；形态特征多样且不易观察；大多数种类体表高度骨化，依据形态特征进行物种鉴定时，必须对标本进行透明(一般为浸泡在乳酸中一周至一个月时间)后在显微镜下观察。经过这些步骤处理后的标本便很难再从中提取DNA。为保证分子数据与形态鉴定所对应标本的一致性，需要首先提取甲螨的DNA，并尽可能保留其形态结构特征，然后再进行传统的形态学物种鉴定(Rowleyetal., 2007)。

为解决这些问题，近年来有不少学者曾尝试探讨过保存凭证标本的无损伤DNA提取技术。高艳等研究并改进了小型节肢动物无形态损伤的DNA提取方法(高艳和卜云, 2014)；单振菊等也曾研究过一种具厚几丁质外壳微小节肢动物无损伤DNA提取方法(单振菊等, 2017)。但这些方法在甲螨中的应用效果并不是很理想。国外学者Ota等(2011)、Ahaniazad等(2018)虽然针对甲螨无损伤DNA提取方法进行过探讨，并取得了一定的进步，但Ota等的方法只在某些甲螨类群(卷甲螨科Phthiracaridae、洼甲螨科Camisiidae和长单翼甲螨科Protoribatidae)中可以提取出足够的DNA，不能在所有的甲螨DNA提取中取得良好的效果。Ahaniazad等提供的方法需要自己配制试剂，这与应用商品化的DNA提取试剂盒相比将会更加耗时，特别是当样本量非常多时，显然会耗费大量的时间，而且自己配制试剂进行DNA提取也不容易保证DNA质量的稳定性。因此，非常有必要在无形态损伤DNA提取方面继续改良技术。

本研究在前人研究的基础上，结合了试剂盒DNA提取法，提出一套针对甲螨无形态损伤的高效DNA提取方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1甲螨的获得

在北京市奥林匹克森林公园(N40°0′46.29″, E116°22′50.30″)柏树林下采集土壤样本，将土样放在布氏漏斗(Berlese-Tullgren funnel)中，自然风干120 h，并在布氏漏斗底部放一个盛有30 mL无水乙醇的200 mL烧杯用来收集甲螨标本，在收集过程中及时补充无水乙醇。

将收集到的甲螨标本在体视显微镜下查看，挑选数头形态特征相同的个体，通过清洗、透明、制作临时玻片后在系统显微镜下观察形态特征，经鉴定后均为大翼甲螨科Galumnidae大翼甲螨属Galumna显大翼甲螨中华亚种Galumnaobviussinensis(Jacot, 1922)。然后在其它土样分离得到的甲螨中挑选该种标本，用于后续研究。

1.1.2试剂

QIAGEN组织和血液DNA提取试剂盒。

1.2 方法

1.2.1DNA的提取

向6个灭菌的1.5 mL离心管中各放入1头甲螨样本，再向6个离心管中各加入180 μL Buffer ATL，之后再分别加20 μL蛋白酶K，混匀后，55℃水浴24 h，次日取出离心管，分别向每个离心管中加入200 μL Buffer AL，然后70℃水浴10 min。再从水浴锅里取出离心管，向离心管里加入200 μL无水乙醇。将离心管内的液体充分混匀之后，将离心管内所有的液体全部转移到吸附柱内，并将离心管内存留的甲螨标本用蒸馏水冲洗干净后放入80%乙醇中保存。将吸附柱放进离心机中8 000 rpm离心1 min，换上新的收集管，向吸附柱内加入500 μL的Buffer AW1，再将吸附柱放进离心机中8 000 rpm离心1 min，再换上新的收集管，向吸附柱内加入500 μL Buffer AW2，此时将吸附柱放进离心机中14 000 rpm离心4 min。最后换上灭过菌的离心管，向吸附柱内加入50μL Buffer AE，将离心管静止1 h后，再将其放进离心机中8 000 rpm离心2 min。在-20℃保存DNA模板。

1.2.2PCR扩增反应

PCR反应体系：正反引物各1 μL，PCR Master Mix 15 μL，ddH2O 3 μL，DNA模板5 μL。扩增引物如下：正向引物Lco1490：5′-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3′；反向引物Hco2198: 5′-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3′；引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR扩增的反应条件如下：96℃预变性3 min，95℃变性10 s，46℃退火30 s，72℃延伸1 min，运行35个循环。最后72℃延伸5 min。

1.2.3PCR反应产物检测

每个样本取5 μL PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，结果用凝胶电泳成像系统观察。

1.2.4测序及比对

将电泳分析有目的条带的PCR产物原液送北京天一辉远生物科技有限公司进行常规纯化双向测序。为验证所提取的DNA确实是来自于甲螨的DNA，将测序所得结果与GenBank数据库进行比对，以确定PCR扩增序列以及DNA模板是否正确。

1.2.5临时玻片标本的制作

将提取完DNA之后保留下来的甲螨标本放在凹形载玻片上，滴上少许乳酸，稍微调整甲螨肢体的姿势使其便于观察；轻轻盖上盖玻片，用吸水纸在载玻片上吸收多余的乳酸；稍等片刻，在显微镜下观察并拍照。拍照后将甲螨标本放入80%乙醇保存。

1.2.6扫描电镜拍照

将提取完DNA之后保留下来的甲螨标本放在脱水硅胶中脱水24 h，脱水后的甲螨喷金后放入扫描电镜下拍照，以观察其形态特征是否完好。

2 结果与分析

2.1 DNA序列分析

将测序所得的结果与GenBank数据库进行比对，比对结果显示本次实验提取的DNA序列与甲螨亚目中的大翼甲螨科Galumnidae同源性最高，验证了所提取的DNA是来自大翼甲螨科。但由于GenBank数据库中缺少显大翼甲螨中华亚种Galumnaobviussinensis(Jacot, 1922)的DNA序列数据，所以造成与本次实验提取的DNA序列的最高相似度也只有86%左右，并不能达到精确的物种水平的鉴定。

2.2 甲螨标本的形态对比

将未进行DNA提取实验的甲螨标本与经过本次DNA提取实验的甲螨标本分别制作成临时玻片在显微镜下进行形态观察，并进行扫描电镜拍照。对比结果显示：提取过DNA的甲螨标本形态保存完好，并没有发生明显的形态改变(图1)。其重要的分类学特征如：感器(bothridial setae)、梁毛(lamellar setae)、吻毛(rostral setae)、前背板(prodorsum)、后背板(notogaster)、翅形体(pteromorph)、下颚体(subcapitulum)、生殖板(genital plate)、肛板(annal plate)、步足(leg)等均保存完好(图1, 图2)，可以作为凭证标本长期保存。

图1 提取DNA的甲螨标本与未提取DNA的甲螨标本扫描电镜对比照片Fig.1 SEM photographs of oribatid mites with DNA extraction and without DNA extraction注：A，B，背面观；C，D，腹面观；A，C为未提取过DNA的甲螨标本；B，D为提取DNA的甲螨标本。Note: A, B, Dorsal view; C, D, Ventral view; A, C, Specimen without DNA extraction; B, D, Specimen after being DNA extracted.

图2 经过DNA提取之后的甲螨标本形态结构扫描电镜照片Fig.2 SEM photographs of morphological characters after being DNA extracted in oribatid mites注：ad，肛侧毛；ag，侧殖毛；an，肛毛；AP，肛板；bs，感器；GP，生殖板；in，梁间毛；L，步足；le，梁毛；PTM，翅形体；ro，吻毛。Note: ad, Adanal setae; ag, Aggenital; an, Anal setae; AP, Annal plate; bs, Bothridial setae; GP, Genital plate; in, Interlamellar setae; L, Leg; le, Lamellar setae; PTM, Pteromorph; ro, Rostral setae.

3 结论与讨论

本实验所选取的显大翼甲螨中华亚种个体相对较大(体长725～775 μm，宽525～550 μm)，使用此无损DNA提取方法，可以只用一头标本就能提取出足够的DNA。对于其它体型更小的甲螨，可以适当增加甲螨的个数，以保证能够提取出足够的DNA用于后续的分子生物学实验。

随着DNA条形码和分子分类学等新概念的提出，利用基因序列辅助鉴定物种已经越来越普遍，许多分类学者都在积极地参与构建包含不同物种形态特征与分子数据的数据库(Hebertetal., 2003b)。当前，虽然在各大数据库中已收录了一些甲螨物种的DNA序列数据，但是很多的DNA序列都没有凭证标本与之对应，这可能是由于很多情况下在进行DNA提取实验时已经将甲螨标本破坏了，只有一些在DNA提取之前借助显微镜拍摄的照片可供查阅、参考和比较。然而甲螨由于种类众多、形态特征多样、体型微小等因素影响，仅仅根据这些照片一般很难对这些标本的物种鉴定是否正确进行核对，与之对应的分子数据的可靠性无疑会大打折扣，这在一定程度上也限制了甲螨分子生物学的相关研究。

目前对于甲螨的分子分类学工作者们而言，一个较大的难点就是如何将DNA分子数据与甲螨的形态特征数据准确无误地对应起来。在其它体型较大的动物中，通常采取的做法是取标本个体的一小部分来进行DNA提取，其余的部分作为凭证标本进行保存(Starks and Peters, 2002)。甲螨个体微小，很难只取一小部分进行DNA提取就能获得后续实验所需足够的DNA，况且甲螨一般具有较坚硬的外壳，在进行切取的时候很难保证不损伤重要的形态特征，实际操作中很容易造成整个个体都被破坏，从而导致后续无法依据形态特征进行物种鉴定。而使用本研究提供的甲螨DNA提取方法，既能获得足够的DNA，还可以相当完好的保存凭证标本，有助于开展甲螨分子生物学研究。

致谢：感谢蒙皓博士在分子生物学实验中给予的指导，感谢张魁艳老师、李荣同学在扫描电镜观察与拍照过程中给予的帮助。