刘文杰 李巧玲 马科

肺癌是目前全球发病率、死亡率最高的恶性肿瘤,依据肺癌细胞病理类型可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌(NSCLC)［1］,所有肺癌的5 年相对生存率仅为19%,NSCLC 的5 年生存率(23%)高于小细胞肺癌(6%)［2］。因肿瘤的隐匿性,大部分肺癌患者确诊已处于疾病晚期,错过了最佳手术时期,在诸多的治疗方式中化疗仍然是未来治疗NSCLC 的主要手段［3］。化疗在治疗肺癌的过程中常伴随食欲减退、呕吐、骨髓抑制等毒副反应［4］,患者因自身耐受差而影响治疗效果,故而寻求中西医结合治疗。爱康方是马科教授诊治肺癌工作中从中医学、临床效果及现代医学出发筛选出用于治疗肺癌的经验方,在前期研究的基础上本实验将爱康方、生理盐水通过大鼠灌胃,环磷酰胺腹腔注射一定时间,经心脏取血［5］,取含药血清,用不同成分的含药血清体外干预A549 细胞一定时间,检测A549 细胞内Bad、Caspase-9 表达的影响,探讨爱康方治疗肺癌的机理。

1 材料与方法

1.1 材料 动物：雄性SPF 级的Sprague-Dawley(SD)大鼠［宁夏回族自治区实验动物中心,许可证号：SCXK(宁)2017-0001］40 只,体重(220±20)g。细胞：A549 细胞株(武汉普诺赛生命科技有限公司,中国)。

1.2 仪器及试剂

1.2.1 仪器 制冰机(AF10 SCOTSMAN,美国)；去离子水仪(PALL,Purelab Plus,美国)；高速离心机(Eppendorf 公司,德国)；电子天平(Sartorius 公司,德国)；生物分光光度计(Eppendorf 公司,德国)；荧光定量PCR 仪(Applied Biosystems 公司,美国)。

1.2.2 试 剂 Bad(批号：AB90435),Caspase-9(批号：AB52298),Anti-β-actin(批 号：AB179467)(abcam公司,英国)；小鼠二抗试剂盒(批号：PV-9002,北京中杉金桥公司,中国)；天根总RNA 提取试剂盒(批号：DP419,上海生工生物有限公司,中国),Bad、Caspase-9的基因引物(上海生工生物有限公司,中国)；全蛋白提取试剂盒(KGP250)、SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒(KGP113)、Trizol［Invitrogen(Cat# 15596-026)］(凯基生物科技发展有限公司,南京)。

1.3 药品 爱康方药物组成：臭壳虫6 g(云南云南楚雄市,中国),血余炭3 g、花蕊石11 g、生薏苡仁30 g、三七6 g、通关藤30 g、金荞麦30 g、桃仁12 g、紫珠叶30 g (宁夏明德药业有限公司,国药准字H32020857,中国)；环磷酰胺注射液(盛迪医药股份有限公司,中国)。

1.4 方法

1.4.1 药物制备 爱康方药物经鉴定后浓度依据人与动物体表面积公式换算法［6］换算,水煎法浓缩制备药液,参照前期研究结果,本实验采用高剂量(4.74 g/ml)进行后续实验［7］。

1.4.2 动物分组及含药血清的制备 动物分组：40 只大鼠,采用随机分组法分为空白对照组(NS)、环磷酰胺组(CTX)、爱康方组(AKF)和爱康方联合环磷酰胺组(AC),每组10 只。其中爱康方组、爱康方联合环磷酰胺组大鼠环磷酰胺按20 mg/kg 体重比例在第1、3、5 天进行腹腔注射；爱康方组、爱康方联合环磷酰胺组灌胃给药(浓缩药液,1 ml/100 g,2 次/d)；空白对照组给予生理盐水灌胃,量次同爱康方组。连续灌胃5 d,第4 天晚禁食,末次给药后1.5～2 h 用10%水合氯醛麻醉大鼠后体表穿刺心脏取血,血液静置待分层、离心10 min(条件：3000 r/min,4℃)、吸取上清液,封装,56℃水浴灭活,0.22 μm 滤器过滤,同组混合并分装,置-80℃冰箱保存备用。

1.4.3 细胞培养及分组

1.4.3.1 A549 细胞培养 用含10%胎牛血清的高糖DMEM 培养基培养A549 细胞,培养箱37℃,5% CO2培养环境,待细胞长满瓶底的80%左右,取对数生长期细胞用于实验。

1.4.3.2 细胞分组 依据含药血清处理细胞,将细胞分为空白对照组、爱康方组、环磷酰胺组、爱康方联合环磷酰胺组。根据课题前期实验结果,采用20%的含药血清［8］(含药血清：培养基=2∶8)为最佳干预浓度。

1.4.4 实时荧光定量(RT-qPCR)法检测 A549 细胞中Bad、Caspase-9 mRNA 的表达水平 采用天根总RNA 提取试剂提取目标细胞以获得总RNA 并进行逆转录。采用红细胞裂解液(RNase-Free)ddH2O 稀释反应体系到50 μl,-20℃保存。用荧光定量PCR 扩增,扩增反参数为：95℃ 30 s、95℃5 s、60℃ 34 s,共40 个循环。反应结束后按照公式2-ΔΔCt计算mRNA 的含量。引物序列见表1。

表1 PCR 引物序列

1.4.5 蛋白质印迹法(Western blotting 法) 测定A549 细胞中Bad、Caspase-9 蛋白的表达收集处理后的A549 细胞,提取总蛋白,BCA 蛋白浓度检测法检测各组蛋白质含量；依据Bad、Caspase-9 蛋白分子量配备十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)胶,将处理好的蛋白样品样电泳、转膜；然后用5%脱脂牛奶在4℃封闭1 h 后放入一抗工作液(1∶1000)中,4℃过夜后洗膜；二抗反应(1∶3000),室温孕育60 min,最后洗膜、曝光及洗片；以肌动蛋白(β-actin)为对照蛋白,用image J 软件分析灰度值,Bad、Caspase-9 与β-actin 的光密度值比值作为Bad、Caspase-9 蛋白表达的相对量。

1.5 统计学方法 采用SPSS22.0 统计学软件进行数据统计分析。计量资料以均数±标准差 ()表示,采用t检验；多样本均数比较采用one-way ANOVA 检验,组间两两比较采用SNK-q检验；计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-qPCR 法检测A549 细胞中Bad mRNA 的表达水平 48、72 h 时,环磷酰胺组、爱康方组和爱康方联合环磷酰胺组Bad mRNA 表达水平高于空白对照组,爱康方联合环磷酰胺组Bad mRNA 表达水平高于环磷酰胺组和爱康方组,差异具有统计学意义(P＜0.05)；48 h时,环磷酰胺组Bad mRNA 表达水平高于爱康方组,差异具有统计学意义(P＜0.05)；72 h 时,爱康方组Bad mRNA 表达水平与环磷酰胺组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。48、72 h 时,空白对照组与环磷酰胺组Bad mRNA 表达水平组内比较差异无统计学意义(P＞0.05)；72 h 时,爱康方组和爱康方联合环磷酰胺组Bad mRNA表达水平高于本组48 h,差异具有统计学意义(P＜0.05)。见图1-1,图1-2,图1-3。

2.2 RT-qPCR 法检测A549 细胞中Caspase-9 mRNA的表达水平 48、72 h 时,环磷酰胺组、爱康方组和爱康方联合环磷酰胺组Caspase-9 mRNA 表达水平高于空白对照组,爱康方联合环磷酰胺组Caspase-9 mRNA 表达水平高于环磷酰胺组和爱康方组,差异具有统计学意义(P＜0.05)；48 h 时,环磷酰胺组Caspase-9 mRNA 表达水平高于爱康方组,差异具有统计学意义(P＜0.05)；72 h 时,爱康方组Caspase-9 mRNA 表达水平与环磷酰胺组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。48、72 h 时,空白对照组与环磷酰胺组Caspase-9 mRNA 表达水平组内比较差异无统计学意义(P＞0.05)；72 h 时,爱康方组和爱康方联合环磷酰胺组Caspase-9 mRNA表达水平高于本组48 h,差异具有统计学意义(P＜0.05)。见图1-4,图1-5,图1-6。

2.3 Western blot 检测A549 细胞内Bad 蛋白的表达48、72 h 时,环磷酰胺组、爱康方组和爱康方联合环磷酰胺组Bad 蛋白表达水平明显高于空白对照组,环磷酰胺组、爱康方联合环磷酰胺组高于爱康方组,爱康方联合环磷酰胺组高于环磷酰胺组,差异具有统计学意义(P＜0.05)。72 h 时,空白对照组和环磷酰胺组Bad 蛋白表达水平与本组48 h 比较差异无统计学意义(P＞0.05)；爱康方组和爱康方联合环磷酰胺组Bad 蛋白表达水平高于本组48 h,差异有统计学意义(P＜0.05)。见图2-1,图2-2,图2-3。

2.4 Western blot 检测A549 细胞内Caspase-9 蛋白的表达 48、72 h 时,环磷酰胺组、爱康方组和爱康方联合环磷酰胺组Caspase-9 蛋白表达水平明显高于空白对照组,环磷酰胺组、爱康方联合环磷酰胺组高于爱康方组,爱康方联合环磷酰胺组高于环磷酰胺组,差异具有统计学意义(P＜0.05)。72 h 时,空白对照组和环磷酰胺组Caspase-9 蛋白表达水平与本组48 h 比较差异无统计学意义(P＞0.05)；爱康方组和爱康方联合环磷酰胺组Caspase-9 蛋白表达水平高于本组48 h,差异有统计学意义(P＜0.05)。见图2-4,图2-5,图2-6。

3 讨论

肺癌作为全世界常见癌症之一,其中NSCLC 约占85%,而小细胞肺癌仅占15%［9］。NSCLC 的治疗具有阶段性,其中Ⅰ期或Ⅱ期的患者在无禁忌证的前提下行手术切除治疗,非手术患者则应考虑采用常规或立体定向放射治疗［10］。化疗则成为了不可或不能切除肿瘤者治疗方式的主要选择之一［11］。但考虑到部分NSCLC 患者对化疗治疗存在化疗耐药性,导致化疗后NSCLC 的复发率仍偏高［12］。与此同时在癌症常规治疗中,抗肿瘤药物也常会导致血象改变、贫血、血管疾病、肝损伤和肺部疾病及许多皮肤病表现［13］。中医药与化疗药物配合在一定程度上能增强治疗作用,缓解相关不良反应,改善化疗后不适感［14］。单味中药和中药复方在防治或延缓NSCLC 耐药方面有一定的作用［15］。实验证明,中药扶正祛邪复方对多药耐药性有逆转效果,并对白血病细胞产生了抑制作用［16］。

肺癌在中医学角度常被认为是正亏邪侵,正邪相互搏结,痰瘀交结所致［17］。塞上名医马科教授治疗肺癌的实效经验组方爱康方,功主清热解毒、消瘀散结,从病因对肺癌进行治疗。方以金荞麦为君药取其解毒祛瘀,清热排脓之意；通关藤合紫珠叶,功善活血散肿、止咳平喘、除热解毒,增强金荞麦解毒、排脓抗癌之力,共为臣药；花蕊石、血余炭、三七、桃仁在祛瘀活血同时兼止血,祛中有收,共为佐药；薏苡仁健脾渗湿,合君药取培土生金之意,唯一虫类药臭壳虫功可解毒散结,共为使药。药理学研究证明,金荞麦中的优效组分异鼠李素能上调Bax、Caspase-3 的表达,下调Bcl-2、cyclinD1 和PCNA 蛋白的表达,诱导肺癌A549细胞凋亡［18］；通关藤能通过促进凋亡相关蛋白、下调血管内皮生长因子(VEGF)-2、VEGF-A、白细胞介素-10(IL-10)和丙二醛(MDA)等达到抗肿瘤作用［19］。学者从大叶紫珠分离出的化合物能HepG-2、MCF-7细胞株产生抑制作用［20］。花蕊石能诱导SMMC-7721细胞凋亡、抑制增殖,其效果跟药物剂量和作用时间有着密切关系［21］；桃仁提取物可以调控炎症因子、调解血脂［22］,亦能效防治和控制血瘀证的发生［23］。

细胞凋亡是由基因控制的自主有序死亡,部分抗肿瘤药物则通过诱导细胞凋亡方式以达到治疗肿瘤目的。BH3-Only 蛋白Bad 是Bcl-2 家族的成员,具有促凋亡蛋白的特性。去磷酸化的Bad 转位到线粒体膜上,在线粒体膜上结合并失活(Bcl-2 和Bcl-xl)抗凋亡蛋白。Bad 表达量的高低与癌症患者的预后紧密相关。因此,Bad 在连接细胞生存信号通路和凋亡信号通路中作用不可或缺［24］。Caspase 是一种半胱氨酸酶或天冬氨酸蛋白酶,是一种内源性细胞凋亡启动者,调节生理性细胞死亡和病理组织退变。启动子Caspase(Caspase-1、-2、-8、-9、-10)与激活平台结合后通过二聚化激活,再通过蛋白水解性切割激活下游效应Caspase(如Caspase-3、-6 和-7),进而激活更多的启动子Caspase。而Caspase-9 活化发生在凋亡小体中,由凋亡蛋白酶激活因子1 (Apaf-1)和细胞色素c组成的低聚物结构,其能使线粒体外膜通透性改变,并将细胞色素c 的释放进入细胞质。Caspase-9 可以激活效应分子Caspase,或通过Caspase-9 裂解基序包围天冬氨酸残基裂解靶蛋白。Caspase-9 活化最典型的结果是下游效应物Caspase 的裂解,从而诱导凋亡细胞死亡［25］。

RT-qPCR 检测Bad、Caspase-9 mRNA 的表达,表明爱康方在基因水平与环磷酰胺起到协同作用,从而促进肿瘤细胞凋亡；Western blot 从蛋白表达定量的角度进一步表明爱康方联合环磷酰胺能上调促凋亡蛋白Bad、Caspase-9 的表达,从而起到抗肿瘤生长作用。

综上所述,爱康方能抑制肺癌肿瘤生长,与环磷酰胺合用抑癌效果更佳,可能是通过上调A549 细胞中促凋亡蛋白Bad、Caspase-9,诱导肿瘤细胞凋亡而实现的。