徐思源 吕靖 魏琼 金青青 肖静 李清

人类每日需要睡眠,睡眠不足会影响人类健康,降低机体免疫力,增加患病风险。尤其对于妊娠期女性,睡眠剥夺的发生率大大增高［1］。随之而来的是睡眠剥夺对其造成的多种不良影响,相关研究发现,妊娠期间MSD 不仅可增加孕妇自身高血压、糖尿病、产后抑郁、早产等患病风险,还可对子代造成多种不良影响［2,3］。有研究指出孕鼠MSD 会引发子代海马区神经炎症及损伤子代认知功能［4］。但具体机制尚不明确,因此有必要进一步探究其相关机制。JAK2/STAT3 通路的激活与炎症密切相关。其参与多种炎症过程且与脑损伤有关。丙泊酚作为临床上广泛应用的静脉麻醉药物,不仅有镇静作用,还有抗炎、抗氧化等非麻醉作用［5,6］。因此本篇文章通过建立孕鼠MSD 模型,探讨丙泊酚对孕鼠MSD 后子代大鼠海马区及神经炎症的影响及与JAK2/STAT3 通路的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 本研究获得了湖北医药学院动物护理与使用委员会的批准。本研究选用孕18 d SD 大鼠,所有孕鼠均来自湖北医药学院实验动物中心,丙泊酚注射液购自中国阿斯利康制药有限公司、JAK2 抗体、p-JAK2 抗体、STAT3 抗体、p-STAT3 抗体均购自美国Cell Signaling Technology 公司,GAPDH 抗体购自美国Proteintech Group 公司,ELISA 试剂盒购自欣博盛公司,裂解液、SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液(5X)购自中国碧云天公司,蛋白酶、磷酸酶抑制剂购自瑞士Roche 公司、SDS-PAGE 凝胶快速配制试剂盒购自中国Servicebio 公司,电泳装置、凝胶成像分析系统、酶标仪购自美国Bio-Rad 公司,组织匀浆机购自江苏友联仪器研究所,低温高速离心机购自德国Eppendorf,水迷宫购自上海欣软信息科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备及药物处理 将12 只孕18 d SD 大鼠按照随机数字表法分为：对照组(Con 组)、睡眠剥夺组(MSD 组)、睡眠剥夺+丙泊酚组(MSD+Pro组),每组4 只。本实验采用水平台睡眠剥夺法对孕鼠睡眠剥夺。水平台设备为自制水平台睡眠剥夺箱,箱内放置4 个平台,孕鼠可于平台间自由活动,每个平台直径为6.5 cm,使用时剥夺箱内注入清水至距平台1 cm 处,保证箱内水温于25℃,孕鼠可自由获得水和食物。从MSD 组及MSD+Pro 组分别随机选取1 只孕鼠进行为期72 h 的睡眠剥夺,睡眠剥夺后将孕鼠放回原笼中饲养待产,待其产出子代7 d 后行相应处理。向MSD+Pro 组新生7 d SD 大鼠腹腔内注射20 mg/kg 丙泊酚［7］,注射完成后使其仰卧于动物电热毯上,动态监测大鼠血氧饱和度,密切观察其呼吸频率及皮肤颜色确保无缺氧情况发生,待其翻正反射恢复后第2 日清晨,依据随机数字表法每组选取5 只新生大鼠,喂养至第31 天,行水迷宫实验。其余新生大鼠安乐死后取海马组织行其他检测。

1.2.2 蛋白质印迹定量分析 各组分别于冰上迅速取出3 只安乐死大鼠大脑并剥离取出海马组织。海马组织称重后加裂解液经研磨机研磨后静置、离心。取上清,加入对应上样缓冲液,在100℃下煮沸10 min,得到蛋白样本进行电泳。通过电泳装置将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF 膜)上。室温下用5%脱脂牛奶将膜封闭1.5 h。封闭后,将膜与目标一抗置于4℃冰箱孵育过夜。第二日晨使用TBST 缓冲液清洗3 次膜后用山羊抗兔或山羊抗鼠二抗在室温下孵育1.5 h,再次使用TBST 缓冲液洗膜3 遍后应用Western blot 凝胶成像分析系统对膜进行拍照和分析。

1.2.3 酶联免疫吸附试验(ELISA) 各组分别于冰上迅速取出5 只安乐死大鼠大脑病剥离出海马组织,用预冷的PBS 缓冲液冲洗海马组织并用滤纸吸干表面水分,称重后放入匀浆机中。每100 毫克海马组织用1 ml 预冷的PBS 匀浆。5000 r/min 低温离心10 min,取上清液。按照试剂盒说明书,测定海马组织中促炎性细胞因子的含量。

1.2.4 Morris 水迷宫 Morris 水迷宫是一项检测实验动物空间学习和记忆能力实验。共有4 个象限：N,S,E,W。分为定位航行实验和空间探索实验。定位航行实验进行4 d,提前1 d 对大鼠进行训练,在训练过程中,动物们被引导到一个隐藏的平台,在测试阶段记录大鼠1～4 d 寻找隐藏平台的时间。空间探索实验在测试的第5 天进行,此时将平台移除,将新生大鼠放于水中,使其不受干扰地游泳,记录新生大鼠在目标象限内停留的时间和穿越平台的次数。

1.3 观察指标 比较各组子代大鼠Morris 水迷宫实验结果,包括各组搜索平台时间、穿越平台次数和目标象限停留时间百分比。比较各组子代安乐死大鼠JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 蛋白的相对表达情况及海马组织中促炎性细胞因子含量。

1.4 统计学方法 采用SPSS21.0 统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差()表示,采用t检验,P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组子代大鼠Morris 水迷宫实验结果比较MSD 组子代大鼠于第3 天、第4 天搜索平台时间明显长于Con 组,差异均有统计学意义(P＜0.05)；MSD+Pro组子代大鼠于第3 天、第4 天搜索平台时间明显短于MSD 组,差异均有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 各组子代大鼠搜索平台时间比较(,s)

表1 各组子代大鼠搜索平台时间比较(,s)

注：与Con 组比较,aP＜0.05；与MSD 组比较,bP＜0.05

MSD 组子代大鼠目标象限停留时间百分比和穿越平台次数均显著低于Con 组,差异均有统计学意义(P＜0.05)；MSD+Pro 组子代大鼠目标象限停留时间百分比和穿越平台次数均显著高于MSD 组,差异均有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 各组子代大鼠穿越平台次数和目标象限停留时间百分比比较()

表2 各组子代大鼠穿越平台次数和目标象限停留时间百分比比较()

注：与Con 组比较,aP＜0.05；与MSD 组比较,bP＜0.05

2.2 各组子代安乐死大鼠JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 蛋白的相对表达情况比较 MSD 组子代安乐死大鼠p-JAK2、p-STAT3 相对表达水平明显高于Con组,差异均有统计学意义(P＜0.05)。MSD+Pro 组子代安乐死大鼠p-JAK2、p-STAT3 相对表达水平明显低于MSD 组,差异均有统计学意义(P＜0.05)。见图1,表3。

表3 各组子代安乐死大鼠JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 蛋白的相对表达水平()

表3 各组子代安乐死大鼠JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 蛋白的相对表达水平()

注：与Con 组比较,aP＜0.05；与MSD 组比较,bP＜0.05

2.3 各组子代安乐死大鼠海马组织中炎性细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α 表达水平比较 MSD 组子代安乐死大鼠炎性细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α 表达水平均明显高于Con组,差异均有统计学意义(P＜0.05)。MSD+Pro 组子代安乐死大鼠炎性细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α 表达水平均明显低于MSD 组,差异均有统计学意义(P＜0.05)。见表4。

表4 各组子代安乐死大鼠海马组织中炎性细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α 表达水平比较(,pg/ml)

表4 各组子代安乐死大鼠海马组织中炎性细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α 表达水平比较(,pg/ml)

注：与Con 组比较,aP＜0.05；与MSD 组比较,bP＜0.05

3 讨论

与妊娠早期女性相比,妊娠晚期女性睡眠质量更差、睡眠时间更短［8］。基于此,MSD 对子代的影响,已成为备受关注的问题。研究指出产前应激可损伤子代认知功能,影响子代身体发育［9］。因此本实验通过构建妊娠晚期孕鼠睡眠剥夺(MSD)模型进一步研究MSD 对子代的影响。本次研究结果显示：MSD 组子代大鼠于第3 天、第4 天搜索平台时间明显长于Con 组,差异均有统计学意义(P＜0.05)。MSD 组子代大鼠目标象限停留时间百分比和穿越平台次数均显著低于Con组,差异均有统计学意义(P＜0.05)。MSD 组子代安乐死大鼠炎性细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α 表达水平均明显高于Con 组,差异均有统计学意义(P＜0.05)。说明MSD 可损伤子代大鼠学习和记忆能力及导致子代大鼠海马区神经炎症。

丙泊酚是一种广泛应用于成人及小儿麻醉的静脉麻醉药物。丙泊酚有多种麻醉优势如起效快、苏醒迅速等,它也具有多种非麻醉作用,其中包括抗炎、抗氧化、神经保护等［5,10］。研究指出丙泊酚可以减轻大鼠睡眠剥引起的学习记忆能力的降低及海马区神经炎症［11］。研究证明丙泊酚可减少异氟醚麻醉所致胚胎及子代小鼠海马区炎性细胞因子IL-6 的释放及改善其认知功能损伤［12］。但目前尚缺少丙泊酚与MSD 后子代大鼠的影响的相关研究。本次研究结果显示：MSD+Pro 组子代大鼠于第3 天、第4 天搜索平台时间明显短于MSD 组,差异均有统计学意义(P＜0.05)。MSD+Pro 组子代大鼠目标象限停留时间百分比和穿越平台次数均显著高于MSD 组,差异均有统计学意义(P＜0.05)。MSD+Pro 组子代安乐死大鼠炎性细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α 表达水平均明显低于MSD组,差异均有统计学意义(P＜0.05)。说明丙泊酚可减少MSD 后子代大鼠的学习和记忆能力的损伤及减少子代大鼠海马区神经炎症,从而起到脑保护的作用。然而其相关机制尚不清楚。

JAK2/STAT3 信号通路是重要的信号转导途径,是介导多种免疫反应及炎性介质传递的信号转导通路［13］。JAK2/STAT3 通路的激活可影响多种促炎性细胞因子的表达,如TNF-α、IL-6［14］。促炎性细胞因子IL-6 也可引发JAK/STAT3 通路的激活,致使T细胞分化从而激活小胶质细胞释放更多促炎性细胞因子［15,16］。研究指出缺血性脑卒中后,位于小胶质细胞的STAT3 过度激活会加重小胶质细胞的激活和神经炎症,且抑制JAK2/STAT3 通路的激活可减轻脑缺血损伤和神经炎症［14,17］。本研究结果显示：MSD 组p-JAK2、p-STAT3 相对表达水平明显高于Con 组,差异均有统计学意义(P＜0.05)。MSD+Pro 组子代安乐死大鼠p-JAK2、p-STAT3 相对表达水平明显低于MSD 组,差异均有统计学意义(P＜0.05)。说明JAK2/STAT3 通路激活可介导MSD 后子代大鼠海马区神经炎症,且丙泊酚可抑制妊娠晚期孕鼠睡眠剥夺后所致子代大鼠海马区JAK2/STAT3 信号通路的激活及神经炎症的发生从而起到脑保护作用。

综上所述,丙泊酚可抑制妊娠晚期孕鼠睡眠剥夺后所致子代大鼠海马区JAK2/STAT3 信号通路的激活及神经炎症的发生。本实验研究了丙泊酚对孕鼠睡眠剥夺后对子代的影响及其可能相关机制。可为临床上睡眠剥夺后新生子代麻醉提供一定参考,然而丙泊酚与MSD 后子代神经炎症机制复杂,其具体机制尚需进一步研究。