武军旭，赵平歌，黄 毅，芦玥同

(西安工业大学建筑工程学院，陕西西安 710021)

环境污染，特别是突发性水污染事件，是全世界面临的一个严重问题[1]，它将破坏生态环境，危害人类健康，造成严重的经济资产损失，是影响社会稳定的不确定因素[2]。因此，快速准确预警水质突变对实现事故的紧急控制和应急安全处理非常重要。据统计，1995年—2012年我国水体突发性污染事件发生总次数为11 640次，年均达到647次[3]。2020年中国生态环境状况公报显示，全国发生各类突发环境事件共208起[4]，其中包括我国近20年来尾矿泄漏量最大、应急处置难度最大、后期生态环境治理修复任务异常艰巨的突发环境事件——伊春鹿鸣矿业“3·28”尾矿库泄漏事故[5]。虽然传统的理化监测在连续自动采样和实时分析等技术方面已经取得了重大进展，但当前针对快速发展的未知化学危害混合物进行实时预警的能力仍然有限[3]。从神经毒理学的角度来看，急性暴露下，意外或故意行为进入淡水供应的化学制剂可能影响神经系统，故只能使用适当的功能生物模型进行可靠评估[6-7]。

目前，对于突发性污染水体监测的研究更多是连续监测敏感水生生物的行为和生理参数，常用的监测生物包括发光细菌[8-9]、藻类[10]、大水蚤[11]和鱼类[12-13]等。其中，鱼类作为水质监测预警“传感器”的应用更早，也更成熟[14-15]，可对多种人为引起的环境破坏作出显著和可预见的反应，包括温度[16]、富营养化[17]、酸化[18]、化学污染[19]、物理栖息地的改变[20]等。鱼类对周围水生环境健康的敏感是利用它们监测环境突变的基础[21]。任宗明等[22]通过低压电信号采集日本青鳉的行为变化，实现对污染水体的水质变化报警。马中雨等[23]、杜娟娟等[24]研究证明，基于鱼类行为变化的水质监测系统对浑浊度、石油类、亚硝酸盐、苯、砷化物、锰、高浓度苯酚都较为敏感。Tian等[25]和Alfonso等[26]研究表明，行为的变化往往先于身体损伤可见之前就受到影响。基于此，实时生物预警系统(biological early warning systems，BEWS)应运而生，填补了传统水质监测的不足[27]。然而，各种因素如生物有机体本身的复杂性、设备误差和环境噪声，均可能会影响模型预测的准确性和及时性[28]，且对较低浓度的污染物识别能力差。即使是已经发展较为先进完善的BEWS系统也避免不了假阳性和假阴性警报等相关的问题[27,29]，这些问题可能源于生物体本身或生存环境，例如鱼群的求偶行为[30]、溶解氧浓度[27]以及尚未检测到的其他因素。

快速发展的机器学习和深度学习在预测水质状况方面表现出明显的优势，概率神经网络(PNN)[31]、自组织映射(SOM)[31]、隐马尔可夫(CHMM)[32]、支持向量机(SVM)[33]和Adaboost算法[34]等算法确定水质与异常行为特征间的定性关系，这些算法一定程度上促进了BEWS的发展。但预警系统假阳性和假阴性的情况还是不可避免，而且对特征污染物生物预警阈值等级的研究较少。

目前，基于斑马鱼丰富的行为表现已经被证明是一种强大的水生脊椎动物模型[35]。鉴于此，本试验所用模式生物选择AB系蓝色斑马鱼，利用视频追踪技术，对试验过程中5条斑马鱼的速度、加速度、运动高度、距离、轨迹密度、转弯次数进行实时采集。以正常水体中斑马鱼行为指标的变化为基础，模拟CuCl2不同浓度突发污染暴露下斑马鱼的行为反应，并利用Hinkley算法对各行为指标进行优化处理，最后通过对各类行为指标赋予权重得到不同浓度下的综合报警指数Y，进而验证Hinkley算法预警的真实性和时效性。

1 基于Hinkley算法水质突变分级报警模型的建立

1.1 Hinkley算法

Hinkley算法是一种用于衡量观测量中长期效应的统计算法，它的特点是最大限度地剔除了短期变化对观测值的估计影响[36]。在水质预警中，正常水质条件下的斑马鱼各行为指标均在一定的范围内，进而导致不同毒性浓度下的Hinkley函数值变化趋势不明显，而异常水质条件下的斑马鱼行为指标的变化异于正常水质，故运用这种算法来衡量各个运动指标的中长期变化。

以速度为例，计算如式(1)。

(1)

其中：G(t)——t时刻的Hinkley函数值；

G(t-1)——t-1时刻的Hinkley函数值；

U0——正常水体中速度的均值，mm/s；

U1——正常水体中速度的均值U0与平均速度标准差σ之和，mm/s；

Zt——速度指标的监测值，mm/s。

1.2 水质突变分级报警模型

在Huang等[13]的研究基础上，进一步将斑马鱼运动行为指标分3类：速度、加速度为Ⅰ类(活动强度)；运动高度、转弯次数为Ⅱ类(位移强度)；距离、轨迹密度为Ⅲ类(聚散强度)。

为了防止个别行为指标的突变导致系统误报，研究对各类指标赋予权重，进而计算综合报警指数Y，计算如式(2)。

Y=0.4×G(t)Ⅰ+0.3×G(t)Ⅱ+0.3×G(t)Ⅲ

(2)

其中：0.4、0.3、0.3——赋予Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类指标的权重(权重值的设定和鱼的种类、年龄、不同指标对污染物的敏感程度密切相关，可根据反复试验摸索确定，速度的变化较其他指标更敏感，故与速度有关的系数可以适当定高一点[36])；

G(t)Ⅰ、G(t)Ⅱ、G(t)Ⅲ——Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类指标Hinkley函数值。

Y和预警等级如表1所示。初级警报提供预警，表示水质有可能已经被污染，此时鱼群行为出现异常；中级警报提供预先警报，表示水质即将达到临界阶段，20%～40% 的鱼群出现尾巴停摆的中毒现象；高级警报表示水质已经达到临界阶段，40% 以上的鱼群出现翻肚的现象。

表1 分级报警Tab.1 Grading Alarm

2 实例分析

2.1 斑马鱼的驯养

本实验室斑马鱼由中国科学院武汉水生所提供，试验用水均为曝气24 h后的脱氯自来水，水温维持在(26±1) ℃，pH值控制在6.6～7.2，光照周期为12 h∶12 h，投食频率为2～3次/d。试验时挑选鱼龄为3～6个月、体长为(35±2)mm的斑马鱼，每组试验用鱼5条，试验前24 h不喂食。

2.2 试验试剂

氯化铜(CuCl2，分析纯，阿拉丁)，使用时先配置成质量浓度为1 g/L的母液。

2.3 试验设计

参照《水质 物质对淡水鱼(斑马鱼)急性致死毒性的测定》(GB/T 13267—1991)，利用概率单位图解法计算出CuCl2的24 h半致死质量浓度(24 h-LC50)为0.5 mg/L。本研究以24 h-LC50为1个毒性单位(1.0 TU)，观察记录0.2 TU(质量浓度为0.1 mg/L)、1.0 TU(质量浓度为0.5 mg/L)、2.0 TU(质量浓度为1.0 mg/L)暴露下斑马鱼运动行为指标的变化。

试验利用视频跟踪技术对斑马鱼的活动强度、位移强度、聚散强度进行实时监测，模拟重金属突发污染下的水质环境，记录分析斑马鱼在水质污染前后的各运动行为指标变化，并利用Hinkley算法对各指标进行优化处理，引入综合报警指数Y，建立了水质突变分级报警模型。

试验用水采用半静态式流水试验，控制进水流速为15 L/h，水温维持在(26±1)℃，pH值控制在6.6～7.2，背景灯控制光照强度为50 lux。试验共进行240 min，前120 min为正常水质条件，记录斑马鱼在正常水质条件下的各运动行为指标的变化，从第120 min开始加入CuCl2溶液，记录该条件下斑马鱼各运动行为指标的变化。根据生物的急性毒性试验设定每个质量浓度共进行3 个平行样，每个平行样的指标数据均为5 条鱼的平均数，结果以3 个平行样的平均数记录显示。

图1 不同浓度的CuCl2突发暴露下斑马鱼活动强度变化Fig.1 Changes of Activity Intensity of Zebrafish Exposed in Different Concentrations of CuCl2

图2 不同浓度的CuCl2突发暴露下斑马鱼位移强度的变化Fig.2 Changes of Displacement Intensity of Zebrafish Exposed in Different Concentrations of CuCl2

3 结果分析

3.1 CuCl2对活动强度的影响

如图 1(a)～图 1(d)所示，斑马鱼在前120 min处于正常水体中，速度变化相对稳定，主要在29.00～52.00 mm/s。0.2 TU时，在暴露后历时11 min速度达到最大值，为70.60 mm/s，随后历时66 min恢复至暴露前水体中斑马鱼运动速度的波动范围；1.0 TU时，在暴露后历时6 min达到最大值，为77.28 mm/s，在46 min后降至暴露前均值的37.32%，最终速度维持在9.00～29.00 mm/s；2.0 TU时，在暴露后历时12 min达到最大值，为80.28 mm/s，历时29 min后达到暴露前均值的25.54%，最终维持在1.00～20.00 mm/s。

如图 1(e)～图 1(h)所示，斑马鱼在前120 min的正常水体中，加速度在-0.450～0.400 mm/s2。0.2 TU时，加速度在暴露后12 min才发生明显增高，并在暴露后第14 min，由暴露前的-0.001 mm/s2增至0.420 mm/s2，但加速度整体的变化范围与暴露前并没有显著差别；1.0 TU时，在暴露后的第10 min加速度由暴露前的0.001 mm/s2增至0.480 mm/s2，加速度整体的变化范围与暴露前加速度变化范围没有显著差别；2.0 TU时，在暴露后的第5 min，加速度由暴露前的-0.001 mm/s2变为-0.750 mm/s2，随着时间的增长，加速度维持在-0.150～0.130 mm/s2。

由以上分析可知，速度与加速度在污染物暴露后发生短暂、快速的变化，变化范围明显高于暴露之前的水平。与接触低浓度毒性相比，高浓度毒性时，除了经历明显的升高，随着时间的增长，最终没有维持在污染物暴露前的水平，而是快速下降，最终稳定在一定的范围。

3.2 CuCl2对位移强度的影响

如图 2(a)～图 2(d)所示，运动高度在前120 min的正常水体中变化相对稳定，前120 min运动高度的均值为140.26 mm；在第120 min时，即斑马鱼接触到CuCl2污染物后，不同毒性浓度的CuCl2下斑马鱼的平均高度敏感性又不相同。0.2 TU时，运动高度在暴露后12 min才明显增高，随着暴露时间的增长，平均运动高度又逐渐恢复至暴露前正常水体中的水平；1.0 TU时的运动高度在暴露后2 min骤降，与0.2 TU相比，1.0 TU时的运动高度并没有随着时间的增长而恢复至暴露前的水平，而是在第217 min后发生二次骤降，最终维持在39.60～95.60 mm；2.0 TU时，运动高度在污染物暴露后即刻呈现下降趋势，并在149 min下降至37.68 mm，与暴露前均值相比下降约75.6%，最终维持在23.80～49.30 mm的水平。

如图 2(e)～图 2(h)所示，转弯次数在污染物暴露之前变化稳定，主要在3.47～13.73 n/(10 s)，转弯次数的均值为8.32 n/(10 s)，标准差为2.27 n/(10 s)，在120 min后，转弯次数整体均呈现先短暂升高后又下降趋势，斑马鱼在0.2、1.0、2.0 TU的CuCl2水体中持续暴露2 h后转弯次数依次变为4.7、5.0、0.66 n/(10 s)。

由以上分析可知，低浓度毒性时，运动高度的变化明显滞后于转弯次数的变化，并随着时间的增长，斑马鱼运动能力逐渐恢复。转弯次数在短时间内急剧上升，毒性越强，反应强度越剧烈。

图3 不同浓度的CuCl2突发暴露下斑马鱼聚散强度的变化Fig.3 Changes of Gathering Strength of Zebrafish Exposed to Different Concentrations of CuCl2

3.3 CuCl2对聚散强度的影响

如图3(a)～图 3(d)所示，在污染物暴露之前，鱼群距离变化在一个稳定的范围内，在120 min后，0.2、1.0、2.0 TU下斑马鱼的平均距离均呈现下降后上升波动变化，最终通过自我调节适应，平均距离又恢复至污染物暴露前的水平。

如图3(b)～图3(h)所示，轨迹密度与距离的变化趋势相似，均呈现下降后上升，最终通过自我调节适应，轨迹密度又恢复至污染物暴露前的水平。

由以上分析可知，在污染物暴露后的短期内，鱼群距离出现快速减小的趋势，鱼群出现短暂的聚集现象，进而导致轨迹密度短时间内降低。

3.4 综合报警指数的变化和分级报警效果

如图4所示，不同毒性浓度下的Y随着时间的变化均呈现递增的趋势。

在0～120 min，Y呈线性变化，通过线性拟合可知，试验组与空白组斜率相差不大。空白组斜率为0.07；0.2 TU组斜率为0.10；1.0 TU组斜率为0.13；2.0 TU组斜率为0.07。具体结果如表2所示。

在暴露后20 min的时间段内，空白组斜率为0.06，与暴露前相比变化不大；0.2 TU组斜率为0.40，与暴露前相比增加近300.0%，较空白组增加566.7%；1.0 TU组的斜率为0.45，与暴露前相比增加了246.2%，较空白组增加650.0%；2.0 TU组的斜率为0.62，与暴露前相比增加了785.7%，较空白组增加933.3%。毒性浓度与曲线斜率呈正相关。

在第120 min后，Y出现了显著的分级现象，这是在污染物暴露下，斑马鱼对周围环境做出应激行为反应所造成的，故利用综合报警指数Y可以对水质环境做出及时预警。

图4 不同浓度CuCl2暴露下的综合报警指数YFig.4 Comprehensive Alarm Index Y under Different Concentrations of CuCl2

表2 回归性分析统计Tab.2 Statistics of Regression Analysis

研究通过实时采集Y并与分级报警(表1)进行对比，进而划分预警等级，再通过斜率判别报警的真伪。结合表2和图4，得到不同浓度的CuCl2突发胁迫下不同时间段的分级报警结果,如表3所示。

表3 不同浓度CuCl2下的分级报警结果Tab.3 Grading Alarm Results under Different Concentrations of CuCl2

4 讨论

低浓度毒性的Cu2+对斑马鱼造成氧化应激需要时间的积累。以往研究表明，Cu是鱼类等动物所必需的微量元素，存在于动物的组织中，是许多代谢活动所需酶的重要辅因子[37]，低剂量的Cu2+可以发挥抗氧化作用对抗氧化应激[17]。此外，水中离子强度对也会对毒性机制产生影响。一些研究发现，鱼对Cu的摄取是通过Na+，依赖于Na+对鱼类鳃中的Cu转运体或上皮Na通道的干扰，但Ca和Mg单独作用可减轻斑马鱼的Cu毒性[38]。这可能是0.2 TU暴露下没有使斑马鱼在9 min内产生应激反应的原因。

从不同浓度CuCl2暴露对斑马鱼行为影响试验结果可知，与对照组相比，斑马鱼对CuCl2产生了一定的“回避反应”[39]。根据相关研究，Cu2+在斑马鱼体内累积直至超过肌体所需的阈值，鱼群开始出现心理应激(回避污染导致的急速游动)和身体应激(出血或感染)等行为[40]，这与Alfonso等[26]中所述的压力应对方式(stress coping style)的调节一致。随着暴露时间的增长，低浓度下的斑马鱼状态逐渐恢复。0.2 TU时，其活动强度、位移强度(运动高度)和聚散强度分别历时52～54、60～75、37～55 min恢复至暴露前的水平，这与Lu等[41]描述的内在调节机制作用相吻合。1.0 TU时，仅有加速度、运动高度的变化范围逐渐恢复至暴露前的水平，其余参数都经历了行为强度降低的过程。王英才等[42]研究表明，这种变化可能是污染物浓度增大、加速后的疲劳效应以及对胁迫环境的适应所致。与1.0 TU相比，暴露于2.0 TU下的斑马鱼呈现明显的中毒迹象。这种随着毒性浓度与斑马鱼行为强度变化的依赖性关系与黄东龙等[43]和Huang[13]的研究一致。Ren等[44]将斑马鱼毒性行为的变化描述为逐步行为响应模型，主要包括无效应、刺激、适应、调整(重新调整)和毒性效应。

本研究基于Hinkley算法设置了以斑马鱼活动强度、位移强度和聚散强度“三位一体”的水质突变预警系统，在水质突变后每隔20 min预警一次，且随着时间的变化，预警等级会随着水质污染的情况发生相应的变化。以往的研究表明，Hinkley算法可有效解决水生生物运动的随机性、复杂性和非线性导致的误报警现象，但系统稳定性和灵敏度不太好[36]。马欣等[36]只对“第一压力阈”之前速度、高度、距离以及活鱼条数进行了监测，未监测“第一压力阈”之后的参数变化，即未监测毒性效应暴发时斑马鱼状况。但水质污染和水体净化都是长期变化的过程，需要长期的监测数据并对水质变化作出实时评价。本研究在此基础上，兼顾了试验结果的可靠性和稳定性，精选了6个斑马鱼行为参数，并将其划分为3类，每组试验进行240 min，前120 min为斑马鱼在正常水体中的适应阶段，后120 min为污染物暴露后的阶段，设计充分考虑了环境压力模型中斑马鱼行为强度变化的4个阶段。综合报警指数Y预警等级的划分是经过前期预试验结果所设置，具有一定的局限性。这种对特征污染物划分预警等级的设计早在理化监测技术上得到了实践发展，例如，行业规范标准[《生活饮用水卫生标准》(GB 5749—2006)、《地表水环境质量标准》(GB 3838—2002)等]的制定。但生物监测手段对特征污染物毒性阈值设定还有待完善。

5 结论

斑马鱼在CuCl2突发暴露后，其活动强度(速度和加速度)、位移强度(运动高度和转弯次数)和聚散强度(距离和轨迹密度)均会在短期内发生明显变化。以此为基础，通过Hinkley算法对行为指标进行优化，引入综合报警指数Y，建立了水质突变分级报警模型，通过对CuCl2突发暴露下斑马鱼运动行为指标的实时监测，证明了Hinkley算法在水质预警方面的准确性和有效性，为水质状况评估、水质安全性评价等工作提供了参考。