莫壁伶，余市成，钟惠娟，林海真，周治来

（1.广州市荔湾中心医院，广州 510130；2.广东省第二人民医院，广州 510137）

慢性心力衰竭（chronic heart failure,CHF）是大多数心血管疾病的终末表现，严重威胁我国人民生命健康。心力衰竭可引起一系列的神经体液变化，主要是交感神经兴奋性增强，肾素血管紧张素醛固酮系统（RAAS）激活[1]。众所周知，沙库巴曲缬沙坦可同时作用于脑啡肽酶（neprilysin,NEP）和肾素－血管紧张素双系统，起到排钠利尿、扩张血管以及预防和逆转心室重构的作用，是治疗CHF的新药[2-3]。但除以上两个主要神经体液调节机制，心肌炎症和凋亡也是介导心脏重塑的重要因素[4]，目前关于沙库巴曲缬沙坦对CHF炎症、凋亡的调控作用及机制仍未阐明。本研究通过构建小鼠CHF模型，给予沙库巴曲缬沙坦治疗，探讨其对炎症、凋亡的调控作用及其对心功能的影响，进一步阐明沙库巴曲缬沙坦对CHF心肌的保护机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 8周龄SPF级C57/BL6雌性小鼠30只,购自广东省医学实验动物中心［SCXK（粤）2018-0002］,体重（25±2）g。饲养期间自由进食及饮水。本研究符合动物伦理相关规定。

1.1.2 实验试剂及仪器 沙库巴曲缬沙坦（诺欣妥，国药准字：H20170344，50 mg/片，Novartis公司），阿霉素（sigma），兔抗小鼠CD68单克隆抗体（BIO-RAD），兔抗小鼠Active Caspase-3单克隆抗体（Cell Signal Technology）。小动物心脏超声仪（Vevo 3100 Imaging System），倒置显微镜（型号DMI1，Leica），荧光显微镜（型号TCSSP2，Leica）。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及模型制备 将30只小鼠按随机数字表法随机分成空白组、模型组和治疗组，每组10只。模型组和治疗组采用腹腔注射阿霉素制备慢性充血性心力衰竭小鼠模型。具体方法：灭菌注射用水溶解阿霉素粉针，配成0.8 mg/mL浓度，按1.5 mg/kg的剂量每3 d一次进行腹腔注射，连续给药6周，期间空白组小鼠予以等量生理盐水。

1.2.2 药物治疗方案 造模成功后开始药物治疗，治疗时间为4周。治疗组小鼠灌胃沙库巴曲缬沙坦（68 mg/kg），空白组和模型组小鼠予以等量生理盐水。

1.2.3 心脏超声检查 在治疗结束后，采用超声心动图（vevo 3100 imaging system）对小鼠进行高频超声心动图检查。具体方法：小鼠吸入异氟烷气体进行麻醉,探头切迹朝向小鼠头部,观察小鼠心脏运动情况,启动分析测试系统，记录检测的参数包括左心室射血分数（LVEF）、左室收缩末期内径（LVESD）、左室舒张末期内径（LVEDD）、左心室短轴缩短率（LVFS）。

1.2.4 Bio-Plex悬液芯片技术检测各组小鼠静脉血炎症因子浓度 治疗结束后，收集小鼠尾静脉血0.5 mL，离心后取上清，-80℃冻存备用。待所有标本收集完毕，4℃水浴解冻，使用Bio-Plex细胞因子检测试剂盒检测12种细胞因子。按说明书操作：用250μL标准品稀释液溶解标准品冻干粉，并制备连续4倍稀释的系列标准品；在96孔板的每个孔分别加入标准品、稀释液、待测品，随后每孔加入50μL磁性微球。样本孵育完成后，使用Bio-Plex磁力架手动洗板3次除去残留液，将检测抗体加入96孔反应板，25μL/孔。抗体孵育完成后，去除残留液，每孔加入50μL Streptavidin-PE（SA-PE），室温摇床孵育10 min。孵育完成后洗板，加入Assay buffer重悬孔内微球，125μL/孔。室温摇床重悬2 min。运行Bio-Plex 200悬液芯片系统仪器，上机检测。使用Bio-Plex Manager 6.1软件读取并分析数据。

1.2.5 苏木精—伊红（HE）染色及免疫荧光检测治疗结束后，过量麻醉处死动物并快速取出心脏，从3组中各随机挑选5个心脏标本，用4%多聚甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋、4μm厚切片，按标准行HE染色，光学显微镜下观察3组小鼠心肌纤维、心肌细胞排列等情况。石蜡切片常规二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化，柠檬酸钠缓冲液（pH=6.0）修复高温修复5 min，PBS漂洗5 min×3次，山羊血清封闭30 min后加入一抗：兔抗小鼠CD68（1:200）检测炎症细胞浸润情况，兔抗小鼠Active Caspase-3（1∶400）检测心肌凋亡情况。4℃孵育过夜，PBS漂洗5 min×3次，加入二抗Alexa Fluor 594山羊抗兔（1∶500），室温孵育30 min。DAPI复染后封片，Leica荧光显微镜下观察，采用Image J软件分析图片。

1.3 统计学方法 采用SPSS 23.0统计软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 沙库巴曲缬沙坦对心力衰竭小鼠炎症的调节作用

与空白组比较，模型组中6种细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-17、IL-8）显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，治疗组的IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-17显著下降（P＜0.05），见表1。

表1 各组小鼠血清中细胞因子表达情况 pg/mL，，n=5

表1 各组小鼠血清中细胞因子表达情况 pg/mL，，n=5

与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

2.2 心脏超声结果

模型组小鼠心室壁菲薄，室壁运动紊乱，治疗组小鼠LVEF、LVFS显著高于模型组，LVESD、LVEDD显著小于模型组（P＜0.05)，见表2、图1。

图1 3组小鼠心脏彩超图像

表2 各组小鼠超声参数变化 ，n=5

表2 各组小鼠超声参数变化 ，n=5

与空白组比较,*P＜0.05，与模型组比较,#P＜0.05。

2.3 沙库巴曲缬沙坦对CHF小鼠心肌病理的作用

HE染色显示，空白组小鼠心肌细胞排列规则，细胞间隙均匀，细胞核偏小、排列疏松，心肌横纹清晰；模型组小鼠心肌细胞排列紊乱，细胞增大、拥挤，细胞间隙不清，细胞核增大，核型不规则，可见畸形核，细胞核排列紊乱，细胞质染色不均、团块状，心肌横纹结构不清；治疗组小鼠心肌细胞排列规则，细胞轻度增大，细胞间隙尚均匀，细胞核排列尚规则，心肌横纹较清晰。免疫荧光染色显示，空白组小鼠可见散在分布少量CD68阳性巨噬细胞，模型组可见大量CD68阳性细胞，而治疗组CD68阳性细胞数量与模型组相比显著下降（P＜0.05）；在空白组中，Caspase-3阳性表达很低，治疗组Caspase-3阳性细胞数量显著少于模型组(P＜0.05），见表3、图2。

图2 各组小鼠心肌HE染色（A，×400）、CD68阳性细胞（B,×200）和Caspase-3阳性细胞染色（C,×200）的情况（标尺：100μm）

表3 各组小鼠心肌切片CD68阳性面积百分比和Caspase-3阳性细胞数 ,n=5

表3 各组小鼠心肌切片CD68阳性面积百分比和Caspase-3阳性细胞数 ,n=5

与空白组比较,*P＜0.05，与模型组比较,#P＜0.05。

3 讨论

CHF可活体内交感神经兴奋性、激活肾素—血管紧张素醛固酮系统等，导致心肌细胞损伤及重塑[5]。目前认为沙库巴曲缬沙坦作用于脑啡肽酶和肾素—血管紧张素双系统，起到排钠利尿、扩张血管以逆转心室重构的作用，但其对心力衰竭后炎症和凋亡的调控及其在修复心肌中的作用尚未完全阐明。本研究通过构建CHF小鼠模型，予以沙库巴曲缬沙坦治疗，发现其显著下调心力衰竭小鼠促炎因子表达水平，抑制心肌炎症细胞浸润，减轻心肌细胞凋亡，改善心肌重构和增强小鼠心功能。

炎症与心力衰竭的发生发展密切相关[6]。沙库巴曲缬沙坦对CHF炎症调控作用尚未完全阐明。张相杰等[7]指出，沙库巴曲缬沙坦能降低心力衰竭患者血清中IL-33、TNF-α和ICAM1表达水平，改善患者心室重塑，改善心功能。张瑞英等[8]证实，沙库巴曲缬沙坦可以降低急性心梗患者血中IL-6、TNFα和内皮素1的表达水平，改善PCI治疗后的心室重构。国外有研究指出，沙库巴曲缬沙坦可以显著抑制CHF伴射血分数下降患者TNF-α和IL-18的浓度，改善外周血管功能和心功能[9]。以上研究提示，抑制心力衰竭患者体内炎症因子可能是沙库巴曲缬沙坦治疗心力衰竭的机制之一。但这些研究仅仅采用ELISA法检测了少数几种炎症因子。由于心力衰竭会激活体内炎症网络，导致大量炎症因子表达变化，本研究采用Bio-Plex悬液芯片技术检测12种细胞因子，与传统的ELISA方法相比，具有可同时检测多种细胞因子、高敏感性、高精确性的特点，可显著提升一次检测获取单个样本信息的能力[10-11]。结果显示，与空白组相比，6种炎症因子在模型组表达升高，但沙库巴曲缬沙坦可显著下调其中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-17的浓度。这些细胞因子浓度异常升高，可激活机体防御反应、免疫细胞增殖、分化等，导致全身炎症反应。尤其是IL-6，与受体IL-6R结合后形成IL-6/IL-6R复合物，该复合物进一步激活gp130，在心血管系统主要表现为增加血小板数量，增强单核细胞促凝功能，加剧动脉粥样硬化，加重心肌损伤[12]。本研究发现，沙库巴曲缬沙坦治疗组IL-6浓度下降幅度大，提示沙库巴曲缬沙坦的治疗作用强。IL-1β、TNF-α与IL-6的作用类似，均对心肌有毒害作用[13]。

IL-17是调节心肌重构的重要因子。IL-17可以浓度依赖性降低心肌细胞钙离子内流电流幅度，增加炎症通路NF-κB亚基p50和p65的表达，增强炎症反应。IL-17能通过调节TGF-β的生存，促进心肌细胞纤维化，并能通过STAT3信号通路激活Th17细胞分化，加重心肌纤维化[14]。本研究结果显示，沙库巴曲缬沙坦能显著下调CHF小鼠血清IL-17浓度，这可能是其治疗CHF的一个重要机制。但关于IL-10对心肌的作用尚存争议，其即可通过激活巨噬细胞而间接发挥加重纤维化的作用，影响心脏舒张功能。也有研究认为，IL-10等抗炎因子对纤维化作用不明显，基因敲除IL-10并不影响模型动物肌纤维细胞增殖和心肌重塑[15]。本研究发现，与模型组比较，治疗组IL-4、IL-10等抗炎因子浓度比较，差异无统计学意义。推测IL-4和IL-10的具体作用与具体环境有关，关于IL-4、IL-10在沙库巴曲缬沙坦治疗CHF中的具体作用仍需进一步研究。

阿霉素具有较强的心脏毒性，通过长期、反复腹腔注射阿霉素可诱导充血性心力衰竭模型，该操作方法简单、创伤小且重复率高，是一种公认的可用于制作充血性心力衰竭[16]。心脏结构和功能的改变是本研究的重要监测指标，为准确评估沙库巴曲缬沙坦对CHF小鼠心功能的改善作用，本研究在治疗结束时采用高频心脏超声检测所有动物LVEF、LVESD、LVEDD和LVFS，以全面反映各组小鼠心脏功能变化。结果显示，沙库巴曲缬沙坦能显著改善心力衰竭小鼠LVEF、LVESD、LVFS和LVEDD，说明沙库巴曲缬沙坦治疗4周可以显著改善CHF小鼠心肌收缩功能，这与既往研究结果类似[17]。心肌结构与心功能关系密切，长期的血流动力学改变导致心肌重构，包括心肌细胞肥大，心肌纤维增多，最终导致心肌细胞凋亡、坏死，心功能不可逆损伤[18]。本研究的HE染色结果显示，治疗组小鼠心肌细胞结构显著优于模型组，免疫荧光进一步证实，治疗组Caspase-3阳性凋亡细胞、CD68阳性炎症细胞数量显著少于模型组，证实沙库巴曲缬沙坦治疗可以降低CHF小鼠心肌细胞炎症和凋亡反应，改善心肌重构。

综上所述，沙库巴曲缬沙坦可以缓解CHF小鼠心肌炎症细胞浸润和细胞凋亡，改善心室重塑，增强心功能，其机制可能与其下调促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-17等的表达有关。