侯红平，宋 玲，陈腾飞，高云航，彭 博，王彩霞，叶祖光，张广平

（中国中医科学院中药研究所，北京 100700）

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是来自非心源性因素引起的急性感染性疾病，可由多种因素诱发，包括创伤、肺炎、败血症、休克和感染等，主要病理改变为炎性细胞浸润、炎症因子大量产生和弥散在肺部组织，从而出现炎症反应失控，即“炎症风暴”[1-2]，这与新冠肺炎加重期的“炎症风暴”极为类似。血必净注射液由红花、赤芍、川芎、丹参、当归组成，具有化瘀解毒的功效，适用于因感染诱发的全身炎症反应综合征，在试行第四版和第五版《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》中，血必净注射液在西医治疗方案中被推荐用于治疗重型和危重型病例，在中医治疗方案中被推荐用于中期“疫毒闭肺”和重症期“内闭外脱”两个证候的治疗[3-4]。

复方苦参注射液是由苦参、白土苓组成的一种纯中药制剂，具有清热利湿、通络活血、散结止痛等功效，目前广泛用于恶性肿瘤的治疗，能够缓解癌痛及出血[5-6]。现代药理研究表明，复方苦参注射液的有效成分为苦参碱、氧化苦参碱和苦参黄酮类等，不仅具有止痛、抗肿瘤的功能，而且能够调节人体的免疫力，具有抗炎[7]、抗心律失常[8]、抗纤维化[9]等作用。既往研究表明，复方苦参注射液能够抑制巨噬细胞中核因子（NF）-κB的活化，有效阻止人体中炎性因子的释放，保护人体肺组织[5]。本研究旨在对比复方苦参注射液与血必净注射液对ALI大鼠的炎症抑制作用，为临床治疗药物的应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药品和主要试剂 复方苦参注射液购于山西振东制药股份有限公司，批号：20 181034；血必净注射液购于天津红日药业有限公司，批号：1 906251；地塞米松磷酸钠注射液购于贵州天地药业有限责任公司，批号：19110802A。脂多糖（LPS）干粉购于美国Sigma公司，批号：039M4004V；甲醛购于天津市大茂化学试剂厂，批号：20 180801；白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子（TNF-α）购于北京索莱宝科技有限公司；NF-κB酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购于武汉华美生物工程有限公司，批号：C08033095。

1.2 实验动物和分组 SPF级Wistar大鼠，体重180～200 g，购自北京维通利华试验动物技术有限公司，动物使用许可证号：SYXK（京）2019-0003。适应性喂养1周后，将大鼠随机分为7组，分别为正常组、模型组、阳性对照组、血必净注射液组及苦参注射液高、中、低剂量组，每组12只，雌雄各半。

1.3 造模和给药[9]除正常组外，其余各组均口鼻雾化吸入LPS溶液（浓度4 mg/mL）复制急性肺损伤模型，1次/d，15 min/次，连续3 d。造模后立即给药，阳性对照组尾静脉注射地塞米松注射液（4 mg/kg），血必净注射液组腹腔注射4 mL/kg血必净注射液，苦参注射液高、中、低剂量组分别腹腔注射4 mL/kg、2 mL/kg、1 mL/kg复方苦参注射液，正常组和模型组均给予等体积生理盐水，连续给药3 d。末次造模后15 h各组进行第4次给药。

1.4 样本收集 给药后1 h，用10%水合氯醛麻醉（4 mL/kg）大鼠，腹主动脉采血，暴露肺和气管，结扎右肺，PBS灌洗左肺（2次，2 mL/次，30 s/次，合并灌洗液），部分右肺组织加入PBS缓冲液（按1∶10比例），进行组织匀浆。将灌洗液和组织匀浆液离心（2 500 r/min，10 min），取上清，分装。剩余右肺组织以10%甲醛溶液固定，用于病理学观察。

1.5 炎症因子检测 采用ELISA法检测肺灌洗液和组织匀浆中IL-1β、IL-6、NF-κB和TNF-α的含量。检测过程严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.6 组织病理学检查 取右肺组织，以10%甲醛溶液固定，脱水，石蜡包埋，制成4μm厚石蜡切片，行苏木精—伊红（HE）染色，光学显微镜下观察肺组织的病理学变化。根据Roderick的病理学分级标准[10]，将上述肺部损伤状况分为0～3级。0级：肺泡壁完好无增厚，无炎性浸润，无充血；1级：肺泡间隔少量弥散性炎性细胞（中性粒细胞）浸润，肺泡壁未见增厚；2级：肺泡间隔较多炎性细胞（中性粒细胞、单核细胞）浸润，肺泡壁轻微增厚（1～2倍）；3级：肺泡间隔大量的弥漫性炎性细胞（中性粒细胞为主）浸润，个别区域肺泡壁增厚2～3倍。

1.7 统计学方法 应用SPSS 20.0统计软件进行数据处理。不符合正态分布的计量资料以中位数（四分位数间距）[M（P25～P75）]表示，等级资料采用Kruskal-Wallis秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组肺组织HE染色结果 正常组支气管、肺泡结构完整，形态正常；模型组主要表现为肺泡间隔内炎性细胞（中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞）浸润，肺泡间隔增厚，支气管黏膜上皮破坏脱落，伴肺泡絮状物（肺水肿）等渗出性改变；阳性对照组、复方苦参注射液高剂量组和血必净注射液组肺组织的损伤程度减轻，表现为肺间隔轻度增宽，少量炎性细胞浸润，见图1。与正常组比较，模型组肺组织炎性细胞浸润程度升高，阳性对照组、血必净注射液、苦参高剂量组肺组织炎性细胞浸润程度低于模型组，见表1。

图1 肺组织HE病理染色图（×200）

表1 各组肺组织炎性细胞浸润等级比较

2.2 各组肺灌洗液中炎症因子水平比较 与正常组比较，模型组肺灌洗液中IL-1β、IL-6、NF-κB和TNF-α水平升高；与模型组比较，阳性对照组、血必净注射液组及苦参高、中剂量组肺灌洗液中IL-1β、IL-6、NF-κB和TNF-α水平降低，苦参低剂量组IL-6水平降低；与血必净注射组比较，苦参高、中剂量组肺灌洗液中NF-κB水平下降，苦参中剂量组TNF-α水平降低，见表2。

表2 各组肺灌洗液中炎症因子水平比较 pg/mL，M（P25～P75），n=12

2.3 各组肺组织中炎症因子的表达水平比较 与正常组比较，模型组肺组织中IL-1β、IL-6、NF-κB和TNF-α的表达水平升高；与模型组比较，苦参高、中剂量组及阳性对照组肺组织中IL-1β、IL-6、NF-κB和TNF-α表达水平降低，苦参低剂量组和血必净注射液组肺组织IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平降低；与血必净注射液组比较，苦参中剂量组肺组织NF-κB和TNF-α表达水平下降，见表3。

表3 复方苦参注射液和血必净注射液对肺组织中炎症因子表达的影响 pg/μg prot，M（P25～P75），n=12

3 讨论

现代药理研究表明，复方苦参注射液能够抑制肿瘤细胞的生长，增加白细胞的数量，提高机体免疫力，同时对各种实体瘤引起的疼痛和出血具有明显的治疗效果[11-12]。本研究肺组织病理染色显示，模型组肺组织炎性细胞浸润程度高于正常组，而苦参高剂量和血必净组肺组织病理损伤较模型组有一定的改善。提示复方苦参注射液和血必净对急性肺损伤大鼠有肺保护作用。

近年来，复方苦参注射液被用于放射性肺损伤的临床预防和治疗中。研究报道，辅以复方苦参注射液干预的放射性肺损伤患者TGF-β1、TNF-α、IL-6和IL-10水平降低，而CD3+、CD4+、CD4+/CD8+升高[13-15]。提示复方苦参注射液不仅能够提高患者的机体免疫力，同时能够降低机体的炎症水平，从而达到减轻肺损伤的目的。LPS能够激活巨噬细胞，进而促进炎症反应的发生。巨噬细胞是吞噬性白细胞，在先天免疫炎症反应中起重要作用。活化的巨噬细胞分泌各种细胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性细胞因子[16]。其中，TNF-α作为一种重要的促炎介质，参与多种炎症信号通路，其表达对急性肺炎、肺功能损伤等病理生理改变起到关键作用[17]。IL-1β作为机体重要的免疫调节因子，能够促进T细胞和B细胞的增殖、分化，对中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞产生趋化作用，同时诱导IL-2、IL-6和TNF-α等因子的表达[18]。IL-6同样作为一种促炎细胞因子，能够刺激免疫细胞的增殖和分化，激活下游STAT信号传导途径，增强机体炎症反应[19]。因此，TNF-α、IL-1β和IL-6常作为检测炎症反应的指标。本研究中，模型组肺灌洗液和肺组织中TNF-α、IL-1β和IL-6含量升高，阳性对照组、血必净注射液组及苦参高、中剂量组IL-1β、IL-6、NF-κB和TNF-α水平降低，且苦参中剂量组肺灌洗液和肺组织中TNF-α水平低于血必净注射液组。表明复方苦参注射液和血必净注射液均能够缓解LPS诱导的大鼠急性肺损伤炎症反应的发生。

细胞核因子NF-κB是多功能的转录因子，调控着包括细胞因子、炎症因子、趋化因子、细胞黏附和凋亡等相关基因的表达，在机体免疫应答、炎症反应等方面发挥重要作用[20]。NF-κB的活化促使许多编码炎症介质、细胞因子等的促炎基因表达上调，使得炎症反应级联放大。因此，NF-κB表达水平检测可反映机体炎症情况。本研究中，模型组肺灌洗液和肺组织中NF-κB水平升高，阳性对照组、血必净注射液组及苦参高、中剂量组NF-κB表达水平降低，且苦参中剂量组肺组织NF-κB表达水平低于血必净注射液组。表明血必净注射液和苦参注射液均可通过下调NF-κB表达来减轻急性肺损伤大鼠炎症反应。从TNF-α和NF-κB的表达情况来看，高、中和低剂量的苦参注射液没有体现出明显的剂量依赖性，且中剂量的表达效果优于高剂量，推测可能与苦参提取物所含的生物碱类（苦参碱、氧化苦参碱等）具有毒性密切相关，剂量过大时会有不同程度的脏器损伤，并对神经系统造成损伤[9]。同时，炎症因子的表达应与组织病理HE染色等其他指标综合分析，才能得到科学可信的结果。

综上，复方苦参注射液和血必净注射液对LPS诱导的大鼠急性肺损伤均有一定的治疗效果，能够有效抑制肺组织炎症反应，且复方苦参注射液的改善作用更为明显。