黄奕璇，蒋莉夏，何 云，刘 元，杨 斌，黄春英△

（1.广西医科大学药学院，南宁 530021；2.玉林市中医医院，玉林 537000；3.广西中医药研究院，南宁 530021）

肝脏在机体遭受外界持续性刺激（如病毒、酒精、药物、代谢失调等）时，肝脏中胶原蛋白（以Col-Ⅰ和Col-Ⅲ为主）等细胞外基质（ECM）成分过度积累，导致肝纤维化的发生[1-3]。肝纤维化是可逆的，但会进展为肝硬化甚至肝癌，严重威胁人类生命健康[4]。在目前对肝硬化尚无理想病因根治的情况下，有效地防治肝纤维化是一项极为重要的对策。研究表明，在肝纤维化的发病机制中，肝星状细胞（HSC）发挥核心作用[5]。活化的HSC在肝损伤部位移动、增殖，表达各种信号传导蛋白，产生大量ECM成分和细胞因子，是肝纤维化形成的中心环节[5]。因此，有效抑制HSC活化、增殖，减少ECM合成，诱导凋亡和阻滞细胞周期是阻断、逆转肝纤维化的重要策略[6-8]。

棒柄花是大戟科棒柄花属植物，棒柄花叶为棒柄花植物的叶子。棒柄花苷A[反式-4-（1-丙烯基）-苯酚-β-D-吡喃葡萄糖苷，PPGA]是棒柄花叶中主要的苯丙素类物质，具有较强的化学专属性[9]。苯丙素类化合物具有抗菌、消炎、抗氧化、护肝和抗肿瘤等作用。但目前PPGA对肝纤维化的作用及其机制尚未完全阐明。本研究通过白介素-1β（IL-1β）来刺激HSC-T6细胞，建立体外肝纤维化模型，探讨PPGA对HSC-T6细胞增殖、胶原、凋亡及细胞周期的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞、药物和主要试剂 PPGA（纯度≥95%）由广西壮族自治区中医药研究院提取、分离。IL-1β购于PeproTech公司，DMEM高糖培养基购于Gibco公司，胎牛血清购于AusGeneX公司，PBS缓冲液和噻唑蓝（MTT）购于Solarbio公司，细胞周期检测试剂盒和AnnexinV-FITC/7-AAD荧光双染细胞凋亡检测试剂盒购于Elabscience公司，吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）荧光染色试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司，兔Col-Ⅰ、Col-Ⅲ多克隆抗体购于武汉三鹰生物技术有限公司，封闭山羊血清购于北京中杉金桥公司。

1.2 细胞培养 将HSC-T6细胞接种于含有10%胎牛血清和0.5%双抗（青－链霉素）的DMEM完全培养基中，置于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养，以1∶3比例传代，取对数生长期细胞用于后续实验。

1.3 MTT法测定PPGA对HSC-T6细胞活力的影响 取处于对数生长期的HSC-T6细胞，用0.25%胰酶消化，离心、计数，用含10%FBS的DMEM培养液配制成5×104个/mL的细胞悬液，按100μL/孔加入96孔培养板中，置于恒温培养箱中培养。24 h后，分别用不同浓度的PPGA（6.25 mg/L、12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L和800 mg/L）处理细胞24 h、48 h和72 h。另设空白组（不含细胞和药物，只加培养液、MTT、DMSO）和正常对照组（不含药物，只加培养液、MTT、DMSO），每组设3个重复孔。药物作用结束后，弃上清液，换以无血清DMEM培养基配制的MTT（0.5 mg/mL）溶液，继续在恒温培养箱中孵育4 h，弃上清液，然后按150μL/孔加入DMSO裂解细胞，振荡10 min，于490 nm波长处测定吸光度（OD）值，重复测定3次，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=1－[（OD实验组－OD空白组）/（OD正常对照组－OD空白组）]×100%。

1.4 细胞分组及体外肝纤维化模型的建立 取处于对数生长期的HSC-T6细胞，用完全培养液配制成4×104个/mL的细胞悬液，按100μL/孔加入96孔培养板中，在恒温培养箱中培养24 h后，将细胞分为5组，分别为正常对照组、模型组及PPGA高、中、低剂量组。除正常对照组（给予完全培养基）外，其他各组均用IL-1β刺激HSC-T6细胞30 min，建立HSC-T6细胞体外肝纤维化模型。PPGA干预24 h或48 h后，采用MTT法检测PPGA对IL-1β刺激的HSC-T6细胞增殖的影响。

1.5 免疫荧光法检测细胞Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表达 分组处理后，弃上清液，PBS洗涤3次，甲醛固定30 min；PBS洗涤3次，0.5%Triton X-100通透20 min；PBS洗涤3次，山羊血清封闭30 min后吸去多余血清，Col-Ⅰ和Col-Ⅲ一抗4℃孵育过夜；次日，PBS洗涤3次，荧光二抗避光孵育1 h，PBS清洗，用DAPI染细胞核5 min，封片。荧光显微镜下观察并拍照，用Image J软件进行荧光定量并计算平均荧光强度。绿色荧光强度越高，表示目的蛋白表达量越高。

1.6 PI染色检测细胞周期 收集细胞，PBS洗涤后加入0.3 mL PBS重悬细胞，加入1.2 mL无水乙醇，置于-20℃冰箱中1 h；离心，PBS洗涤细胞，加入100μL RNase A并充分悬浮细胞；37℃水浴30 min，加入400μLPI溶液，充分混匀，冰上避光孵育30 min，用流式细胞仪检测细胞周期。

1.7 AO/EB荧光染色实验 按照AO/EB双荧光试剂盒说明书步骤处理细胞。以波长488 nm的紫外光激发，荧光显微镜下观察各组细胞凋亡形态。

1.8 流式细胞术检测细胞凋亡率 收集细胞，按照Annexin V-FITC/7-ADD荧光双染细胞凋亡检测试剂盒说明书步骤，加入500μL Annexin V Binding Buffer工作液重悬细胞，细胞悬液中加入5μL Annexin V-FITC和5μL 7-AAD染色液，混匀，避光孵育20 min，流式细胞仪分析各组细胞凋亡情况。

1.9 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件处理数据，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PPGA对HSC-T6细胞活力的影响 与正常对照组比较，不同浓度PPGA作用HSC-T6细胞24 h、48 h、72 h后，细胞增殖活力均降低（P＜0.05），见图1。PPGA作用于HSC-T6细胞24 h、48 h、72 h的半数抑制浓度（IC50）分别为473 mg/L、100 mg/L、15 mg/L。因此，本研究选择200 mg/L、100 mg/L、50 mg/L分别作为PPGA高、中、低剂量进行后续实验。24 h和48 h后，与模型组比较，PPGA高、中剂量组细胞增殖能力降低（P＜0.05），见图2。本研究选择24 h作为PPGA作用时间进行后续实验。

图1 PPGA对HSC-T6细胞增殖的影响

图2 PPGA对IL-1β激活的HSC-T6细胞增殖活力的影响

2.2 PPGA对HSC-T6细胞Col-Ⅰ和Col-Ⅲ表达的影响 与正常对照组比较，模型组Col-Ⅰ和Col-Ⅲ平均荧光强度升高（P＜0.05）；与模型组比较，PPGA各剂量组Col-Ⅰ平均荧光强度降低，PPGA高、中剂量组Col-Ⅲ平均荧光强度降低（均P＜0.05），见图3、图4。

图3 细胞免疫荧光图（×400）

图4 各组HSC-T6细胞Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表达比较

2.3 PPGA对HSC-T6细胞周期的影响 与正常对照组比较，模型组HSC-T6细胞G0/G1期、S期和G2/M期分布比例差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，PPGA高、中和低剂量组G0/G1期、G2/M期缩短，S期延长（均P＜0.05），见图5。

图5 PPGA对IL-1β刺激的HSC-T6细胞周期的影响

2.4 PPGA对HSC-T6细胞凋亡形态的影响 与正常对照组比较，模型组HSC-T6细胞凋亡形态无明显改变，细胞呈长梭形并发出绿色荧光；与模型组比较，PPGA高、中、低剂量均能促进HSC-T6细胞凋亡，部分细胞呈圆珠状并发出橘红色荧光，见图6。

图6 PPGA对HSC-T6细胞凋亡形态的影响（×100）

2.5 PPGA对HSC-T6细胞凋亡率的影响 模型组与正常对照组细胞凋亡率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，PPGA高、中和低剂量组细胞凋亡率升高（P＜0.05），见图7。

图7 PPGA对IL-1β刺激的HSC-T6细胞凋亡率的影响

3 讨论

肝纤维化及其终末期疾病肝硬化是由多种慢性肝病引起的主要健康问题。在正常生理状态下，HSC-T6细胞处于静息状态；当HSC-T6细胞活化后，细胞增殖增加，呈现肌成纤维细胞样，以Col-Ⅰ和Col-Ⅲ为主要成分的ECM过度沉积[10]。因此，抑制HSC增殖、减少细胞胶原生成和促进胶原降解是抗纤维化治疗的重要策略。研究证明，IL-1β可作为HSC-T6细胞的诱导活化剂[11-12]。本实验采用IL-1β刺激HSC-T6细胞30 min后，细胞增殖能力显著增强，同时Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表达增加；PPGA作用后抑制了HSC-T6细胞增殖，减少Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表达。提示PPGA可抑制HSC-T6增殖、活化，减少ECM过度积累，维持ECM的动态平衡，从而起到抗肝纤维化的作用。

细胞凋亡在维持内环境稳态和清除多余或异常细胞中起着重要的作用[13]。研究发现，促进细胞凋亡是逆转肝纤维化的关键[14]。诱导细胞凋亡是抑制HSC活化和清除已活化的HSC细胞的重要途经之一[15]。当细胞发生凋亡时，会呈现出细胞皱缩、细胞核固缩、细胞骨架解体等特征性形态学变化，其中细胞皱缩是最直观的变化，细胞核固缩是最显著的变化[16]。本研究发现，IL-1β没有明显改变HSCT6细胞形态；但经PPGA干预后，部分细胞出现固缩或呈圆珠状，发出橘红色荧光，且随PPGA浓度增大，呈橘红色荧光的细胞也随之增多，提示PPGA可显著诱导HSC细胞形态发生显著改变，促使细胞凋亡。细胞受到外部刺激后，多种促凋亡蛋白释放，促凋亡蛋白、凋亡蛋白激活因子等在细胞质中结合形成凋亡小体，凋亡小体可进一步诱导活化，促进细胞凋亡[13,15,17-18]。本研究中，与正常对照组比较，模型组细胞凋亡率没有明显变化，而PPGA干预导致HSC-T6细胞凋亡率升高。细胞周期分为G0/G1期、S期和G2/M期，S期是DNA复制期，同时也是细胞周期的关键期[19-20]。本实验中，IL-Iβ刺激对HSCT6细胞周期分布的影响不大，但经PPGA处理后，HSC细胞周期停滞在S期，HSC细胞不能正常进入分裂期，不能完成完整的细胞周期，这可能导致HSC-T6细胞生长延迟。以上结果表明，PPGA能诱导HSC凋亡，并将细胞周期阻滞在S期，这可能与其抗肝纤维化作用有关。

综上所述，PPGA能明显抑制IL-1β刺激的HSC-T6细胞增殖与活化，诱导细胞凋亡，影响细胞周期，并减少细胞内胶原蛋白表达，减轻肝纤维化。本研究为PPGA及棒柄花在肝纤维化的临床应用提供了实验基础。