王 秀，汪 生，陈志武

(安徽医科大学 1.基础医学院药理教研室，2.科研实验中心，安徽 合肥 230032)

硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)被认为是继一氧化碳(carbon monoxide，CO)和一氧化氮(nitric oxide，NO)之后发现的第三种内源性气体信号分子[1]，多年的科学研究揭示脑组织中存在生理浓度的H2S，并参与了心血管系统和神经系统等机体的生理功能调节和病理过程。内源性H2S主要由酶促反应产生，可通过胱硫醚-β-合成酶(l-cystathionine-β-synthetase，CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(l-cystathionine-γ-lyase，CSE)催化半胱氨酸(l-cysteine，L-Cys)生成。另外，3-巯基丙酮酸硫基转移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，3-MST)也可生成H2S[2]。脑组织中含有丰富的H2S合酶，如CBS和3-MST，产生的H2S可起到神经递质或神经调质的作用，发挥多种生物学效应，如促进海马长时程增强而参与学习和记忆功能的调剂，抑制神经炎症反应[3-4]，通过抗氧化应激损伤和抗细胞凋亡等产生较强的神经保护作用[4-6]。

在H2S的神经生物学作用研究中，脑组织中H2S的检测是至关重要的。目前，测定生物样品中H2S浓度的方法主要有亚甲基蓝分光光度法[7]、顶空气相色谱法[8]、反相高效液相色谱法[9]和荧光探针法[10]。其中，亚甲基蓝法简单快速，是检测水和非生物性样品中H2S浓度的最常用的方法。但其敏感性较差，且实验过程中生成了其他的有色物质，可能对665 nm处检测的吸收峰产生影响，使测定结果产生误差；顶空气相色谱法实验不成熟，难以用于实践；反相高效液相色谱法的准确性易受到氧浓度的影响，定量分析有一定难度；荧光探针法具有较高的灵敏度和选择性，但其稳定性低且成本过高。Kage等[11]报道在碱性条件下，将血液中H2S转化为硫离子(S2-)后，用五氟卞基溴(pentafluorobenzyl bromide，PFBBr)衍生化成双五氟苄基硫醚(bispentafluorobenzyl sulfide，C6F5CH2SCH2C6F5)，采用气相色谱-质谱法(gas chr-omatograph-mass spectrometry，GC-MS)检测C6F5CH2SCH2C6F5来确定H2S浓度。目前认为该方法敏感性和特异性均较好，是检测血液样本中H2S的金标准[12]。由于蛋白质中含硫的氨基酸也可产生释放S2-，并且脑组织比血液含有更多的蛋白质，该方法能否检测脑组织中H2S尚未见文献研究报道。因此，本研究优化了脑组织样品的前处理和PFBBr衍生化反应的条件，建立脑组织中H2S的GC-MS测定方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1仪器 安捷伦7890B-7000D型气相色谱三重四极杆质谱仪，由美国Agilent公司出品；XW-80C型旋涡混合器，上海医科大学仪器厂出品；XPE205型分析天平，瑞士ETTLER TOLEDO公司出品；Milli-Q Integral型超纯水系统，由美国Millipore公司出品。

1.1.2药品与试剂 硫氢化钠(sodium hydrosulfide，NaHS)、甲醇(methanol，HPLC级，纯度≥99.9%)，购自美国Sigma公司，批号分别为#SHBL6872V和#WXBD4144V；四硼酸钠(sodium tetraborate，Na2B4O7, 纯度>99.5%)，购自上海麦克林生化科技有限公司，批号：L11197038；五氟卞基溴(pentafluorobenzyl bromide，PFBBr, 纯度为98%)、十四烷基二甲基苄基氯化铵(tetradecyl dimethyl benzyl ammoniumchloride，TDMBA, 纯度为99%)和1,3,5-三溴苯(1,3,5-tribromobenzene, TBB, 纯度>98%)，均购自中国百灵威科技有限公司，批号分别为L950U31、L360U66和L9A0T55；磷酸二氢钾(potassium dihydrogen phosphate，KH2PO4, 纯度≥99.5%)、乙酸乙酯(HPLC级, 纯度≥99.8%)购自国药集团化学试剂有限公司，批号分别为20181209和20200617。

1.1.3实验动物 健康SD大鼠(SPF级)，160～200 g，全部由安徽医科大学实验动物中心提供。实验室内通风良好，饲养温度为(22±3) ℃。实验所用动物生产许可证号为：SCXK(皖)2017-001。

1.2 GC-MS测定方法

1.2.1溶液配制 饱和Na2B4O7溶液：称取1.5 g Na2B4O7，加入到250 mL无氧水中(超纯水煮沸10 min，冷却至室温)，加热溶解，冷却至室温后超声，取上层清澈溶液。TDMBA溶液：称取TDMBA 92.0 mg，加入50 mL饱和Na2B4O7溶液中溶解。NaHS标准品溶液：称取NaHS标准品56.0 mg，加入1 mL饱和Na2B4O7溶液溶解后，稀释成适当浓度的标准溶液(现配现用)。PFBBr溶液：称取PFBBr 104.4 mg，加入40 mL乙酸乙酯溶解。内标TBB溶液：称取TBB 8.0 mg，加入10 mL乙酸乙酯，溶解后得到800 μg·L-1的溶液，临用时稀释成4 μg·L-1。饱和KH2PO4：称取11.0 g KH2PO4，加入到50 mL无氧水中，加热溶解，冷却至室温后超声，取上层无晶体溶液。

1.2.2测定原理 在碱性条件下，H2S转化为HS-后，被PFBBr衍生化生成C6F5CH2SCH2C6F5。通过气相色谱分离和质谱定性后，用C6F5CH2SCH2C6F5的选择离子质荷比(m/z)与TBB的选择离子质荷比(m/z)的峰面积比定量分析。

1.2.3色谱条件 采用HP-5MS(30 m×250 μm×0.25 μm)毛细管柱；色谱柱程序升温：起始温度为100 ℃，保持1.5 min后，以40 ℃·min-1上升到280 ℃，保持5 min；进样口温度为280 ℃；载气为氦气，速度为1.0 mL·min-1；分流比为10 ∶1；进样量0.5 μL。

1.2.4质谱条件 电子轰击离子源，电子能量20 eV。离子源温度为230 ℃，接口温度为280 ℃，四极杆温度为150 ℃，采用MRM模式。内标TBB的一级母离子是314(m/z)，定量离子对为m/z 314→235，定性离子对为m/z 207→191。目标衍生物C6F5CH2SCH2C6F5的一级母离子是394(m/z)，定量离子对为m/z 394→181，定性离子对为m/z 181→161。

1.2.5脑组织样品的处理和衍生化反应 大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，断头取脑，称取0.1 g双侧大脑皮质组织浸入0.9 mL饱和Na2B4O7溶液中匀浆90 s。吸取200 μL脑组织匀浆液，加入1倍量甲醇沉淀蛋白，震荡混匀1 min，离心10 min(12 000 r·min-1,4 ℃)。

取300 μL离心的上清液加入到玻璃试管中，依次加入0.8 mL TDMBA溶液、0.5 mL PFBBr溶液和1.0 mL TBB溶液，震荡混匀2 min。置摇床(250 r·min-1，25 ℃)中反应1 h，加入1.0 mL饱和KH2PO4溶液，震荡混匀1 min，吸取上层有机相离心10 min(12 000 r·min-1)，过0.22 μm有机微孔滤膜，以待进行后续的GC-MS检测。

1.2.6方法学验证 在预实验确定的最佳实验条件下，依据《中华人民共和国药典》关于分析方法验证指导原则进行方法学验证，分别考察GC-MS测定H2S方法的选择性、线性关系与检测限、准确度与精密度、回收率、基质效应以及稳定性等。

1.3 大鼠NaHS给药后，脑组织中H2S浓度的测定将SD大鼠按随机原则分为4组，即生理盐水(NS)对照组、NaHS 1.4、2.8和5.6 mg·kg-13个剂量组，每组6只大鼠，雌雄各半。各组大鼠分别尾静脉注射NS或各剂量NaHS，0.5 h后，断头取脑，分离双侧脑皮质组织并按“1.2.5 脑组织样品的处理和衍生化反应”方法处理后，待GC-MS检测。

2 结果

2.1 色谱分离和质谱定性

2.1.1色谱分离 取64 μmol·L-1的NaHS标准品溶液和NaHS终浓度为64 μmol·L-1的大鼠脑匀浆各200 μL，按前述方法经PFBBr衍生化后，进行GC-MS检测分析。如Fig 1所示，NaHS标准品溶液和加NaHS的大鼠脑匀浆中TBB波峰和C6F5CH2SCH2C6F5波峰的峰形良好，内标出峰时间均为4.8 min，C6F5CH2SCH2C6F5出峰时间均为5.4 min。

Fig 1 Chromatogram of TBB and C6F5CH2SCH2C6F5TBB was used as internal control. Retention time was 4.8 min for TBB and 5.4 min for C6F5CH2SCH2C6F5. A: 64 μmol·L-1 NaHS standard solution; B: Rat brain homogenate spiked with NaHS at a final concentration of 64 μmol·L-1.

2.1.2质谱定性 如Fig 2所示，TBB特征离子有m/z 314和m/z 235，C6F5CH2SCH2C6F5特征离子有m/z 394和m/z 181。参考文献的方法[13]，选择m/z 314→235子离子对定量测定TBB和m/z 394→181子离子对定量测定C6F5CH2SCH2C6F5。

Fig 2 Mass spectra of TBB and C6F5CH2SCH2C6F5TBB was used as internal control. A: TBB; B: C6F5CH2SCH2C6F5

2.2 衍生化反应条件的优化

2.2.1PFBBr浓度 配制1、5、10和20 mmol·L-1的PFBBr系列浓度溶液，分别与含100 μmol·L-1NaHS的脑匀浆液衍生化反应后进行GC-MS检测分析。结果如Fig 3A所示，PFBBr浓度在1～10 mmol·L-1范围内时，C6F5CH2SCH2C6F5与TBB峰面积比随PFBBr浓度增加而增大(P<0.01)。加入20 mmol·L-1PFBBr溶液进行衍生化反应时，峰面积比略有减小，但无统计学意义。因此，本文后续实验的衍生化反应采用10 mmol·L-1的PFBBr。

Fig 3 Optimization of derivatization reaction n=3)A: PFBBr concentration (**P<0.01 vs 10 mmol·L-1); B: Temperature of derivatization reaction(*P<0.05 vs 25 ℃); C: Time of derivatization reaction.(*P<0.05 vs 60 min).

2.2.2衍生化反应温度和时间 为确定衍生化反应的最佳温度，将10 mmol·L-1的PFBBr加入含100 μmol·L-1NaHS的脑匀浆液中分别置25、35和45 ℃ 3个温度下进行60 min的衍生化反应后进行GC-MS检测分析。Fig 3B显示，25 ℃时C6F5CH2SCH2C6F5与TBB峰面积比最大，35 ℃时的峰面积比与25 ℃时的相比略有减小，但差异无统计学意义。45 ℃时的峰面积比与25 ℃时的相比明显减小(P<0.05)。

将10 mmol·L-1的PFBBr加入含100 μmol·L-1NaHS的脑匀浆液中于25 ℃下分别反应30、60和120 min后进行GC-MS检测分析。Fig 3C表明反应进行60 min时，C6F5CH2SCH2C6F5与TBB峰面积比最大。衍生化反应30 min与反应60 min相比，峰面积比明显减小(P<0.05)。衍生化反应120 min与反应60 min相比，峰面积比差异无统计学意义。因此，本文后续实验在25 ℃中进行60 min的衍生化反应。

2.3 方法学验证

2.3.1水溶液中H2S的测定

2.3.1.1 选择性 分别取不加内标TBB的饱和Na2B4O7溶液(用乙酸乙酯代替TBB)、加TBB的饱和Na2B4O7溶液和加TBB的64 μmol·L-1NaHS标准品溶液各200 μL，衍生化反应后进行GC-MS检测分析。Fig 4色谱图显示，加TBB的饱和Na2B4O7溶液和NaHS标准品溶液均出现了明显的TBB特征波峰，NaHS标准品溶液出现了明显的C6F5CH2SCH2C6F5波峰，TBB与C6F5CH2SCH2C6F5的保留时间分别为4.8 min和5.4 min，两者分离完全，峰形良好。不加TBB的饱和Na2B4O7溶液既未出现TBB波峰，也未出现C6F5CH2SCH2C6F5波峰。结果表明本方法对H2S的测定具有明显的选择性。

Fig 4 Selectivity of method for detecting H2S in aqueous solution(GC-MS method)Peak at 4.8 min was for internal control TBB and peak 5.4 min was for C6F5CH2SCH2C6F5. A: Chromatogram of Na2B4O7 solution without TBB; B: Chromatogram of Na2B4O7 solution with TBB; C: Chromatogram of 64 μmol·L-1 NaHS standard solution with TBB.

2.3.1.2 线性关系与检测限 配制浓度分别为1、10、25、50、75和100 μmol·L-1的NaHS标准品溶液，按“1.2.5”项下处理后进行GC-MS检测。以NaHS的浓度为自变量(x)，测得的C6F5CH2SCH2C6F5与TBB峰面积比为因变量(y)做线性回归分析。得到回归方程为Y=0.02169X-0.0015(R2=0.9995)，线性范围为1～100 μmol·L-1。按信噪比S/N≥3，测得本方法检测限(limit of detection，LOD)为0.3 μmol·L-1。

2.3.1.3 准确度与精密度 配制浓度分别为10、50和100 μmol·L-1的NaHS标准品溶液，每个浓度平行6个样品，连续测定3 d。根据当日随行标曲，计算得到各样品浓度。参照标示浓度，利用公式可得准确度和日内、日间精密度。如Tab 1所示，该方法的准确度为-1.41～5.82，日内、日间精密度均<15%，表明本方法测定水溶液中H2S具有良好的准确度和精密度。

Tab 1 Accuracy and precision of method for detecting H2S in aqueous solution and rat brain tissues(n=6)

2.3.1.4 稳定性 配制10、50和100 μmol·L-1的NaHS标准溶液样品，每一浓度平行3个样品，分别考察NaHS标准品溶液在室温25 ℃下保存24 h和衍生化产物C6F5CH2SCH2C6F5在室温25 ℃下保存24 h时的稳定性。如Tab 2结果显示，NaHS溶液的稳定性为44.08%～64.43%，其稳定性不好。C6F5CH2SCH2C6F5的稳定性为93.41%～98.66%，且RSD<15%，表明C6F5CH2SCH2C6F5在室温下具有良好的稳定性。

Tab 2 Stability of method for detecting H2S in aqueous solution(n=3)

2.3.2大鼠脑组织中H2S的测定

2.3.2.1 选择性 分别取空白大鼠脑匀浆液、空白大鼠脑匀浆液(样品处理过程中不加甲醇沉淀蛋白)和NaHS终浓度为64 μmol·L-1的大鼠脑匀浆液各200 μL，按上述优化条件衍生化反应后进行GC-MS检测。Fig 5显示3组样品中均出现了C6F5CH2SCH2C6F5波峰，未加甲醇的脑匀浆样品中C6F5CH2SCH2C6F5与TBB峰面积比明显地大于加甲醇的脑匀浆样品(P<0.01)，加NaHS的脑匀浆样品中C6F5CH2SCH2C6F5与TBB峰面积比也明显地大于加甲醇的脑匀浆样品(P<0.01)。结果表明该方法对测定脑组织中的H2S有明显的选择。

Fig 5 Selectivity of method for detecting H2S in rat brain tissue(GC-MS method)Peak at 4.8 min was for internal control TBB and peak 5.4 min was for C6F5CH2SCH2C6F5. A: Chromatogram of blank rat brain homogenate(with methanol); B: Chromatogram of blank rat brain homogenate(without methanol) ; C: Chromatogram of rat brain homogenate spiked with NaHS at a final concentration of 64 μmol·L-1 (with methanol); D: Differences of peak area ratio of C6F5CH2SCH2C6F5 to TBB between blank rat brain homogenate , undeproteinized blank rat brain homogenate and the rat brain homogenate spiked with NaHS at a final concentration of 64 μmol·L-1 n=3). **P<0.01 vs the blank+methanol group.

2.3.2.2 线性关系与检测限 在空白大鼠脑匀浆液中加入NaHS标准品溶液，配制NaHS终浓度分别为0.25、1、4、16、64、256 μmol·L-1的系列脑组织样品，衍生化反应后进行GC-MS分析。以NaHS终浓度为自变量(x)，加入NaHS后增加的C6F5CH2SCH2C6F5与TBB峰面积比为因变量(y)，进行线性回归分析。得回归方程为y=0.021 11x+0.002 5(R2=0.999)，线性范围为0.25～256 μmol·L-1。按信噪比S/N≥3，测得本方法检测限(limit of detection，LOD)为0.1 μmol·L-1。

2.3.2.3 准确度与精密度 配制NaHS终浓度分别为16、64和256 μmol·L-1的脑匀浆样品，每个浓度平行配制6个样品，连续测定3 d。根据当日随行标曲，计算得到各样品浓度。参照标示浓度，利用公式可得准确度和日内、日间精密度。如Tab 1所示，准确度为-7.27～4.20，日内、日间精密度均<15%。结果表明该方法测定脑组织中H2S也具有良好的准确度和精密度。

2.3.2.4 回收率 以加入NaHS标准品后脑组织匀浆液中增加的C6F5CH2SCH2C6F5与TBB峰面积比，按照上述线性回归方程计算回收率。结果如Tab 3所示，含NaHS 16、64和256 μmol·L-1的脑组织样品的测定回收率均在90%以上，表明该方法测定的回收率良好。

Tab 3 Recovery, matrix effect and stability of method for detecting H2S in rat brain tissues

2.3.2.5 基质效应 配制NaHS终浓度分别为16、64和256 μmol·L-1的脑匀浆样品，每个浓度平行配制6个样品，测得加入NaHS后增加的C6F5CH2SCH2C6F5与TBB峰面积比为A1。另用饱和Na2B4O7溶液配制NaHS浓度为16、64和256 μmol·L-1样品，每个浓度平行配制3个样品，计算得各浓度C6F5CH2SCH2C6F5与TBB峰面积比均数为A2。按公式M=A1/A2×100%计算基质效应M。如Tab 3所示，该方法测得M在93.12%～97.63%之间，表明本方法无明显的基质效应。

2.3.2.6 稳定性 配制NaHS终浓度分别为16、64和256 μmol·L-1的脑匀浆样品，每个浓度平行配制3个样品，衍生化反应后立即进行GC-MS检测分析，得到C6F5CH2SCH2C6F5与TBB峰面积比。将反应产物于室温25 ℃放置24 h后，再次测定峰面积比，计算其稳定性。结果如Tab 3所示，3个浓度的NaHS脑组织样品的衍生化产物在室温25 ℃保存24 h的稳定性在93.49%～97.15%之间，表明该方法测定在常温下较为稳定。

2.4 静脉注射NaHS对大鼠脑皮质组织中H2S浓度的影响本实验中大鼠脑皮质组织中基础H2S浓度通过测定NS组大鼠脑皮质组织C6F5CH2SCH2C6F5与TBB峰面积比，根据NaHS标准品溶液制备的标准曲线求得。结果如Fig 6所示，大鼠脑组织中基础H2S浓度为(11.84±0.38) μmol·L-1。静脉注射1.4、2.8和5.6 mg·kg-1NaHS后，脑组织中的H2S浓度呈剂量依赖性增加，2.8 mg·kg-1与5.6 mg·kg-1组大鼠脑组织中的H2S浓度与NS对照组相比有显著性差异。结果表明外源性H2S可透过血脑屏障进入脑组织。

Fig 6 Effect of intravenous injection of NaHS on H2S concentration in rat brain n=6)**P<0.01 vs NS.

3 讨论

H2S为多种细胞产生、释放的内源性气体[1]，可参与调节体内许多生理功能和一些病理过程。当pH为7.4时，体液中的H2S约40%以气体形式存在，60%以HS-形式存在，但pH为9.5时，主要以HS-形式存在[14]。弱碱性的饱和Na2B4O7溶液不仅可促进H2S转化成HS-，还可提供HS-与PFBBr衍生化反应所需的碱性环境[15]。衍生化反应生成的硫衍生物C6F5CH2SCH2C6F5热稳定、挥发性强、具有强电子捕获性，适用于GC-MS法检测H2S。

在GC-MS法检测C6F5CH2SCH2C6F5来定量脑组织H2S中，HS-与PFBBr的衍生化反应条件是十分重要的。本研究对衍生化反应中PFBBr的浓度、反应的时间和温度进行了优化，发现衍生化反应中的PFBBr最适浓度为10 mmol·L-1，最适反应时间和反应温度分别为60 min和25 ℃。

本研究对C6F5CH2SCH2C6F5的GC-MS法检测水溶液和大鼠脑组织中H2S的方法学均进行了研究。研究结果表明该方法不仅对水溶液中H2S的检测具有明显的选择性、良好的准确度和精密度，对大鼠脑组织中H2S的检测也同样具有选择性和良好的准确度、精密度。本文在实验中观察到，未加甲醇沉淀蛋白的空白大鼠脑组织中C6F5CH2SCH2C6F5与TBB峰面积比明显地大于加甲醇的空白大鼠脑组织样品(P<0.01)。可能是由于脑组织中含有大量的蛋白质，蛋白质中含硫的氨基酸释放S2-，使测定的峰面积比增加。因此，脑组织样品处理时应加入甲醇沉淀蛋白，尽可能减小蛋白质的S2-对H2S测定产生影响。文献报道大鼠脑组织中H2S的浓度在几十到一百多微摩尔每升，该方法检测脑组织中H2S的线性范围为0.25～256 μmol·L-1，LOD为0.1 μmol·L-1，并且不存在明显的基质效应，可满足脑组织中H2S的检测。因此，C6F5CH2SCH2C6F5的GC-MS法是检测脑组织中H2S的一种可靠、有效的方法。

在该方法检测脑组织中H2S的稳定性研究中，将样品H2S衍生成C6F5CH2SCH2C6F5后在室温25 ℃下保存24 h，检测稳定性良好。在水溶液中H2S检测稳定性研究中，观察到样品衍生化生成的C6F5CH2SCH2C6F5在室温25 ℃下保存24 h，检测也具有良好的稳定性。但样品直接在25 ℃下保存24 h，则检测稳定性较差，这可能与C6F5CH2SCH2C6F5稳定性好，而样品H2S易于挥发溢出有关[16]。因此，应用C6F5CH2SCH2C6F5的GC-MS法检测H2S时，应在采样后尽快或衍生反应完成24 h内完成检测，可减少因H2S挥发导致的影响。

本文采用了C6F5CH2SCH2C6F5的GC-MS法检测了大鼠脑组织中H2S。检测结果表明健康SD大鼠脑皮质组织中基础H2S浓度约为(11.84±0.38) μmol·L-1，明显低于文献报道的亚甲基蓝法测定的大鼠脑内H2S浓度在50～160 μmol·L-1范围[17]。是否由于亚甲基蓝法在665 nm处检测H2S时，易受到其它物质的干扰，造成检测值偏高，而C6F5CH2SCH2C6F5的GC-MS法检测H2S具有良好的选择性，前处理时去除了大部分蛋白，更接近体内H2S真实浓度，当然这还有待于今后进一步的研究证实。同时，本文也观察到静脉注射NaHS后，大鼠脑皮质组织中的H2S浓度呈剂量依赖性增加，这不仅验证了C6F5CH2SCH2C6F5的GC-MS法可以检测脑组织中H2S，也表明外源性H2S可透过血脑屏障进入脑组织。

综上所述，本文成功建立了C6F5CH2SCH2C6F5的GC-MS法检测脑组织中H2S的方法，为脑组织中H2S的定量测定提供了一个可靠、有效的方法，并证明外源性H2S可透过血脑屏障进入脑组织。