陈明心，王炜，张岱，任伟宏(河南中医药大学第一附属医院检验科，郑州450000)

乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)作为传染病项目，其时效性决定临床输血、内镜、手术等能否及时开展[1]。传统的ELISA需2 h[2]，化学发光法也需30 min以上[3]。目前HBsAg快速检测主要运用胶体金法，该方法受主观因素影响大，弱阳性样本漏检率高[4]。因此，需要寻找新的快速检测方法。

连续监测法多用于生化检验领域[5-6]，其特点是无需等到反应终点，不断监测反应过程，找出合适分析点。连续监测法快速、准确。目前免疫检测多需“洗板”[7-8]，该步骤中断了免疫反应过程，因此，连续监测法未能在免疫检测领域得到应用。

均相光激化学发光免疫分析技术是一种以表面包被有亲和涂层的受体微球和供体微球为载体的均相免疫学检测技术[9-10]，2种微球各自包被双抗体夹心法中的一种抗体，当反应体系中抗原抗体相互结合时，2种微球距离拉近，单线态氧可从供体微球传递到受体微球，并转化为光信号，否则，单线态氧无法有效传递，光信号缺失，通过该方法来区分结合相和未结合相，无需“洗板”，实现液体和液体的均相反应。本次研究尝试在均相反应体系中应用连续监测法分析抗原抗体反应以缩短检测过程，提高临床诊疗效率。

1 材料和方法

1.1仪器与试剂 LiCA500、LiCA800光激化学发光全自动免疫分析仪(北京科美公司)。LiCA配套HBsAg检测试剂，包含试剂A、试剂B以及LiCA检测系统共用通用液(北京科美公司)；质控品(0.2 IU/mL，北京康彻思坦公司)；校准品(0.05 IU/mL，北京科美公司)。

1.2方法

1.2.1商品化检测程序(方案1)选取样本 按照试剂盒说明书进行。取样本、试剂A、试剂B各25 μL进行混合，37 ℃温育反应17 min(温育1)后，加入175 μL通用液再37 ℃温育反应15 min(温育2)，其cut off值为0.05 IU/mL，即按照该程序所得结果大于0.05 IU/mL时判断为阳性。

选取该方法检测HBsAg阳性样本128份，无明显溶血、脂血和胆红素血。其中，87例为0.05～0.5 IU/mL范围内的弱阳性样本，阴性样本157例。

1.2.2确定连续监测法检测程序(方案2) (1)确定“温育1”反应时间。取3例阳性样本(浓度范围0.05～0.4 IU/mL)、0.05 IU/mL的校准品和5例阴性样本，将“温育2”稳定在15 min，控制“温育1”时间分别为17 min、15 min、13 min、11 min、9 min、7 min、5 min，阳性、阴性样本均只检测1次，0.05 IU/mL的校准品重复5次，计算均值和标准差，5例阴性样本共同计算均值和标准差，找出阳性样本与阴性样本能够显著区分的最短时间点。

(2)确定“温育2”反应时间。取3例阳性样本(浓度范围0.05～0.4 IU/mL)、0.05 IU/mL校准品和5例阴性样本，采用确定的“温育1”反应时间，控制“温育2”时间分别为0 min、2 min、4 min、6 min，阳性、阴性样本均只检测1次，0.05 IU/mL校准品重复5次，计算均值和标准差，找出阳性样本与阴性样本能够显著区分的最短时间点。

(3)形成连续读数检测程序(方案2)。按照上述确定的“温育1”和“温育2”时间，反应完成后每间隔1 min读数1次，连续读数3次。

1.2.3归一化处理 将1.2.1中选取的样本按照方案2随机选取9 d进行检测，每次试验同时检测0.05 IU/mL校准品。然后分别将3次读数做 “归一化”处理。归一化处理方式如下：第1次读数归一化结果=样本第1次读数÷当次校准品第1次读数，第2次读数归一化结果=样本第2次读数÷当次校准品第2次读数，第3次读数归一化结果=样本第3次读数÷当次校准品第3次读数。

1.2.4将连续变量转化为分类变量

1.2.4.1单次读数转化为分类变量 选取27例低值样本(方案1中检测结果为0.05～0.1 IU/mL)和22例高值样本(方案2检测第1次读数大于0.8 IU/mL)，在SPSS 24.0中，在“转换”菜单下选择“最优分箱”，以“方案1”确定的阴阳性结果作为“金标准”，对3次读数归一化结果分别进行最优化分区段，找出每次读数的最佳分界点。将该分界点作为可疑分界点，将每次读数划分为3个分类变量：小于可疑分界点设定为“c”，介于可疑分界点与1之间设定为“b”，大于1设定为“a”。由此，单次读数结果可转化为“a”、“b”、“c”其中一种。

1.2.4.23次读数转化为综合分类变量 3次读数进行随机排列组合可形成以下10种组合分类变量：“3a”、“2a1b”、“1a2b”、“3b”、“2b1c”、“1b2c”、“3c”、“2a1c”、“1a2c”、“1a1b1c”。由此，3次读数结果可转化为以上其中一种。

1.2.5分类回归树(classification and regressim tree, CART)制定判断规则并进行符合率验证

1.2.5.1确定阴阳性判断规则并进行符合率验证 按照“方案2”所得的结果，将128例阳性样本和157例阴性样本分别标记为1.2.4.2中相应的组合分类变量，然后将“方案1”确定阴阳性结果作为“金标准”，在SPSS 24.0中做CART决策树，随机选取70%样本确定判断规则，30%样本进行验证，并各自进行风险估算。风险估算指数应在0.05以内，验证样本的阴性符合率和阳性符合率应各自达到80%以上。

1.2.5.2确定“可疑”判断规则 确定“金标准”在各组合分类变量中阴性和阳性的例数，找出阴性样本和阳性样本重叠最多的组合分类变量，标记为这些分类变量的样本视作可疑样本，确定为可疑样本的应按“方案1”进行复测。

1.2.6检出限验证 厂商声明的检出限为0.2 IU/mL，根据CNAS-GL038《临床免疫学定性检验程序性能验证指南》，采用0.2 IU/mL康彻思坦质控品，并同时稀释配制出0.1 IU/mL浓度，以这2个浓度的样本每天按照确定的连续读数方案做4次测试，共做5 d。每个浓度样本要求至少有19次测试结果按照1.2.5中制定的规则判断为阳性或可疑为符合要求。至少应符合厂商声明的0.2 IU/mL的检出限要求。

1.2.7阴性复检率比较 比较“金标准”判定为阴性的样本在3次连续读数综合和第1次读数2种方案中判断为“可疑”样本的比例。3次连续读数遵循上述制定的可疑判断规则，第1次读数进行分类变量转化后，标记为“b”的样本判断为可疑。

1.3统计学分析 用SPSS 24.0软件进行卡方检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1确定反应时间 当“温育1”为9、11、13、15、17 min时，“温育2”为4、6 min时，阳性样本和阴性样本有明显区分，且阳性样本检测值均大于cut off值(0.05 IU/mL)。见图1。故确定方案2反应程序：“温育1”反应9 min，“温育2”反应4 min，反应结束后开始读数，之后每隔1 min读数1次，一共完成3次读数，总反应时间为15 min。

注：A,确定“温育1”时间；B,确定“温育2”时间。

2.2单次读数最优分箱结果分析 第1次读数有6例阴性样本大于0.86，所有阳性样本均大于0.86，可疑分界点定为0.86；第2次读数有1例阳性样本小于0.87，所有阴性样本均小于0.87，可疑分界点定为0.87；第3次读数有1例阳性样本小于0.89，有7例阴性样本大于0.89，可疑分界点定为0.89。

2.3CART决策树结果 (1)CART决策树训练数据分析结果及验证结果见图2，基尼指数为0.457，“3c”和“1b2c”归为阴性，“3a”、“2a1b”、“1a2b”、“3b”和“2b1c”归为阳性，对于训练样本的风险估算指数为0.02，对于验证样本的风险估算指数为0.011，均小于0.05，可以达到低风险的要求。验证样本的阴性符合率为100%，阳性符合率为97.5%，均大于95%，符合WS/T 494—2017《临床定性免疫检验重要常规项目分析质量要求》要求。

注：A，训练样本分析结果；B，验证样本检验结果。

(2)落入不同组合分类变量中“金标准”的阴性和阳性结果，“3b”和“2b1c”模式阴、阳性出现了重叠，分别为：“3b”，阴性2例，阳性9例；“2b1c”，阴、阳性各3例。其余分类变量未出现重叠。“2a1c”、“1a2c”、“1a1b1c”没有标本落到该分类中(将此类归为可疑)。

(3)由上得出判断规则：阳性，“3a”、“2a1b”、“1a2b”；可疑，“3b”、“2b1c”、“2a1c”、“1a2c”、“1a1b1c”；阴性，“3c”、“1b2c”。

2.4检出限验证 0.2 IU/mL的康彻思坦质控品5 d检测20次，均为“3a”分类模式,判断为阳性。稀释到0.1 IU/mL时，有8次为“3a”模式，7次为“2a1b”模式、2次为“1a2b”模式，共17次判断为阳性；2次为“2a1c”模式，1次为“3b”模式，共3次为可疑。0.1 IU/mL时，复检数会增加，但不会出现漏检，检出限验证达到要求。

2.5阴性复检率 第1次读数判断方案的阴性复检率为7.64%(12/157)，3次连续读数判断方案的阴性复检率为2.55%(4/157)，两者差异有统计学意义(χ2=4.215，P=0.04)。

3 讨论

HBsAg检测速度达不到需求，将导致临床诊疗效率大大下降，医患纠纷也相应增加。同时在实践工作中，临床大多数仅关注定性结果。鉴于以上实际需求，一种提高临床效率的策略是，先保证大多数人关注的定性以及快速检测问题。而对于少部分需要观察疗效的患者往往对快速检测要求不高，可以通过对目前现有的商业化检测流程进行优化而解决。

通过对反应时间的摸索将反应时间从32 min降低到15 min。对于HBsAg这类对于灵敏度要求较高的传染病项目，快速检测可能会导致弱阳性样本出现漏检。试验设置有临界校准品，经过归一化处理后，样本检测结果大于“1”判为阳性，小于“1”判为阴性。然而，缩短反应时间后，靠近cut off值附近的阳性样本(0.05～0.15 IU/mL)会出现部分检测结果也小于“1”。有学者针对该现象采取了双诊断点，即除了“1”的阴阳性判断点，再增加一个可疑分界点[11]。本次实验通过SPSS最优分箱确定每次读数可疑分界点。

在数据验证中本研究设置了可疑判断规则，然而连续读数法会得到多组数据，这和单次读数设置可疑规则的方式仍有不同，需要采用相应的挖掘算法。CART根据数据集的不同属性对一堆无序无规则的数据进行训练学习，从而训练出一个较为准确的分类模型[12]，该算法输出结果较为直观，容易理解[13]，已在医学领域有广泛应用[14-15]。目前已有通过CART建立阴阳定性诊断模型建立的研究[16]。本次研究尝试采用该算法建立多组数据分析方法，首先将上述3次读数各自转化的分类变量进行随机组合，形成10种组合分类变量，然后通过CART决策树对这10种组合分类变量进行训练，并抽取30%样本进行验证，结果符合率达到要求。然后找出阴阳性样本重叠区域主要出现在哪个分类变量，从而确定3次读数可疑判断规则。检出限验证中0.1 IU/mL样本20次检测数据均不会出现漏检，但是有3次需要进行复检，0.2 IU/mL样本20次数据均可直接判定为阳性，不需复检，符合厂商声称的0.2 IU/mL检出限的要求。

为达到快速检测目的，还应尽可能减少复检率。由于临床中阴性样本出现概率很高，而低值弱阳性样本出现概率较低，且弱阳性样本应常规复检，因此对临床检测周转时间(turnaround time, TAT)有影响的主要是阴性样本复检率。实验结果表明，连续监测多数据分析模式的阴性复检率为2.55%，和缩短时间后只进行1次读数结果相比，阴性复检率下降，两者差异有统计学意义。由此可看出，多次读数可有效减少随机误差波动带来的阴性复检率提高而拖累TAT的问题。

本研究初步尝试了采用多点读数结合CART决策树数据挖掘算法，建立一种快速连续读数检测方案，在保证准确的前提下，实现了免疫定性快速检测。