孙士佳，宋为娟(.南京梅山医院检验科，南京 20039； 2.江苏省人民医院/南京医科大学第一附属医院检验学部，南京 20029； 3.国家医学检验临床医学研究中心分中心，南京 20029)

镰刀菌又称镰孢霉属，常由外伤感染引起人类角膜炎症、眼内炎、足菌肿以及甲板、黏膜、皮肤和皮下组织感染，免疫力下降时可引起脑、心、肺等深部感染，甚至真菌血症[1]。层生镰刀菌(Fusariumproliferatum)是镰刀菌属主要致病菌，广泛存在于环境中，属于条件致病菌，免疫力正常的成人并不多见。因此，临床上镰刀菌感染往往很容易被忽视，且相关文献报道该菌导致的血流感染较少。2021年11月，我院从1例爆炸伤患者血液中分离出1例层生镰刀菌，现报道如下。

1 病历资料

患者男，28岁，于2021年10月24日因金属粉尘及含氟树脂材料爆炸致全身多处烧伤，约30 min后由救护车就近医院救治，诊断为“爆燃伤”，予以气管插管、补液等措施后送至南京医科大学第一附属医院急诊抢救室。患者体温33.6 ℃，脉搏未触及，呼吸26次/分钟，血压70/56 mmHg。双侧瞳孔等大、等圆，左1 mm，右1 mm，双侧对光反射消失。头面颈、双上肢、胸背部、会阴部、臀部、双下肢可见约93%总体表面积(total body surface area，TBSA)Ⅱ-Ⅲ度烧伤，以Ⅲ度为主，行全身CT检查后送手术室行急诊焦痂切开减张术，术后转急诊重症监护室进一步治疗。

多学科专家会诊中指出患者特重度烧伤明确，创伤面积为95%，其中Ⅲ度达90%，属致命伤。早期以抗休克为主，注意晶体、胶体比例及补液量，后期以抗感染为主，尤其血流感染。患者入院当天先予以亚胺培南/西司他丁和万古霉素强化抗感染经验治疗，后根据医院烧伤患者耐药谱改用头孢哌酮/舒巴坦加替加环素联合抗感染，入院后5 d内，痰、血、分泌物培养等未见异常，10月29日血清真菌1,3-β-D-葡聚糖检测(G试验,北京金山川公司试剂，光度法)和曲霉半乳糖甘露聚糖抗原检测(GM试验,美国Bio-Rad公司试剂，ELISA法)结果开始异常升高。入院第7天开始，痰、伤口分泌物标本陆续培养出嗜麦芽窄食单胞菌和阴沟肠杆菌，实验室检查：降钙素原(PCT) 8.44 ng/mL，WBC 23.51×109/L，肌钙蛋白T(TnT) 1 799 ng/L，肌钙蛋白Ⅰ(TnⅠ)阳性，血清肌红蛋白(SMb)238.2 ng/mL。根据体外药敏结果，停用头孢哌酮/舒巴坦及替加环素，予以头孢他啶/阿维巴坦联合氨曲南抗感染治疗。入院第11天，2021年11月4日血培养需氧瓶培养4 d 16 h报阳，直接涂片革兰染色镜检提示丝状真菌阳性。临床接丝状真菌报阳后，于11月4日予以两性霉素B联合泊沙康唑抗真菌治疗，用药后血清真菌G试验结果逐渐转阴，GM试验结果逐渐下降，用药前后G试验和GM试验结果见图1、图2。后续血液培养结果转阴。11月26日，患者循环在持续输液、补液的情况下仍无法维持，当日下午患者临床死亡。

图1 用药前后G试验结果

图2 用药前后GM试验结果

2 微生物学检查及结果

2.1血培养结果及真菌形态 无菌采集中心静脉、导管各一套血培养标本，置于BD公司BACTEC FX全自动培养系统培养，4 d 16 h后中心静脉侧需氧瓶阳性报警，抽取阳性瓶培养液涂片革兰染色，镜检可见有隔真菌菌丝及镰刀形分生孢子(图3A)，阳性培养液转种血琼脂平板和沙氏平板，于26 ℃温箱中培养，48 h后见培养基上气生菌丝呈棉絮状蔓延;72 h后菌落生长迅速，菌落中央有一定程度的束状趋势(图3B);5 d后气生菌丝丰富疏松，中央气生菌丝黏合呈束状，高0.2～0.8 cm，羊毛状，呈白色，背面较正面色深，呈淡黄色或棕黄色(见图3C、3D、3E)。采用透明胶带法进行棉兰染色，镜检可见菌丝和分生孢子，大分生孢子少而细长，多分隔，呈镰刀形；小分子孢子椭圆形至梨形，截平，无厚壁孢子(图3F)。

注：A，阳性培养液革兰染色(×1 000)；B，72 h沙氏平板菌落形态；C、D、E，5 d后血平板、沙氏平板正面、沙氏平板背面菌落形态；F，棉兰染色镜下形态(×400)。

2.2菌种鉴定

2.2.1镜检 结合不同培养条件下的菌落形态及镜下形态，初步考虑镰刀菌属。

2.2.2质谱鉴定 使用甲酸-乙腈超声裂解法对菌株进行前处理，取处理后上清液通过法国生物梅里埃公司Vitek MS质谱仪进行质谱鉴定，结果为Fusariumproliferatum(层生镰刀菌)，置信度99.99%(图4)。

图4 层生镰刀菌质谱鉴定图谱

2.2.3分子生物学鉴定 使用真菌内转录间隔区(ITS)进行基因测序鉴定，引物序列：ITS1，5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′;ITS4，5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，由南京擎科生物有限公司完成引物合成和基因测序。扩增产物大小为500～700 bp，采用ABI 3730测序仪进行双向基因测序。测序结果上传GenBank，经BLAST比对，与层生镰刀菌株EB0732Z6，GenBank登录号 MT372093.1，同源性99.46%，且比对得分最高(1 011)。

2.3药敏结果 依据美国临床和实验室标准化委员会(CLSI)关于产孢丝状真菌的液体培养基稀释法抗真菌药物敏感性试验方案M38-A2方案标准，使用Yeast One YO10型真菌药敏96孔板进行药敏试验，MIC药敏结果如下：两性霉素B(AMB)：1 μg/mL(S)，伊曲康唑(ITR)：1 μg/mL(S)，泊沙康唑(POS)：0.5 μg/mL(S)，伏立康唑(VOR)：1 μg/mL(S)。

3 讨论

镰刀菌是一种在自然界分布广泛的有丝分裂孢子真菌，种类繁多[2]，属于条件致病菌。自1963年我国首次报告镰刀菌致病以来，镰刀菌侵袭性感染尤其在免疫缺陷和免疫抑制患者中的报道逐年增多[3-4]，其发病率和病死率仅次于白念珠菌和曲霉感染[5]，及时诊断、有效治疗以及提高患者免疫力是提高侵袭性镰刀菌感染患者生存率的关键。

镰刀菌在体内具有游离孢子，促进其在血液中传播与生长，侵袭性镰刀菌病血液培养多呈阳性[6]。目前没有商品化试剂盒可用于感染人群镰刀菌种属特异性抗原检测。镰刀菌可释放一种游离抗原，与曲霉菌半乳糖甘露聚糖抗原有交叉反应。研究采用伯乐PlateliaTM曲霉菌抗原检测试剂盒，检测11例明确排除曲霉菌感染的播散性镰刀菌感染患者血清标本，其中9例反复出现阳性[7]。因此，在播散性镰刀菌流行区域，GM试验阳性可作为侵袭性镰刀菌病的辅助诊断指标之一[8]。1,3-β-D-葡聚糖是真菌细胞壁上的一种重要多糖，可在镰刀菌引起的菌血症和肺炎患者血液中检测到[9]，但其缺乏特异性[10]。

本例患者因爆燃伤致全身90%以上的Ⅲ度烧伤，导致表皮的大面积破坏以及体液和细胞免疫紊乱，血液培养分离出层生镰刀菌，根据欧洲癌症治疗研究组/真菌研究组教育和研究共同体(EORTC/MSGERC)有关侵袭性真菌病的定义，可明确诊断为侵袭性镰刀菌感染[11]。因真菌种类及培养方法的不同，其生长时间存在差异。真菌生长速度较慢，患者入院后的强效抗感染药物的使用以及感染初期血液含菌量少，增殖力弱，使得患者在入院11 d后，血液培养4 d才出现培养阳性结果。

免疫缺陷患者镰刀菌感染具有侵袭性和播散性[12]，常出现典型皮疹和持续性不规则发热症状[4,13]。本患者皮肤大面积烧伤，不易发现镰刀菌感染的原发病灶及其引起的典型皮肤病变。严重烧伤患者体液丢失过多，有效循环减少，因此出现低体温状态。此外，镰刀菌播散性感染还会引起镰刀菌性肺炎，本例患者两肺纹理增多，多发斑片影，疑似肺部感染。

免疫功能低下的侵袭性镰刀菌病患者需积极抗真菌治疗。协同研究发现，联合使用两性霉素B和泊沙康唑治疗尖孢镰刀菌感染的小鼠后，其生存期延长，且真菌负荷量降低[14]。本例患者临床接丝状真菌报阳后，予以两性霉素B联合泊沙康唑抗真菌治疗，用药后血清真菌G 和GM试验结果逐渐转阴，同时后续血培养结果转阴。镰刀菌种类繁多，传统形态学方法无法做出准确鉴定，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱、基因测序等方法可准确快速进行菌种鉴定，为临床提供快速、可靠的检验结果。