石 柳，刘 雪，黄 喆，曾德清 (.赣州市人民医院消化内科，江西 赣州 34000；.全南县人民医院消化内科，江西 赣州 34800)

肝癌具有高侵袭转移能力、发病隐匿、潜伏期长、高增殖活性、高复发率等特点，早期难以准确诊断，部分患者确诊时病情已达中晚期，术后5年生存率较低[1-2]。随着精准医学概念的兴起，分子靶向药物逐渐被被应用于肝癌治疗，获得可喜的成效。人类异常纺锤体样小头畸形相关蛋白基因(ASPM)与DNA损伤修复、细胞有丝分裂有关，与肿瘤的发生、进展关系密切，在乳腺癌、神经胶质瘤等多种肿瘤组织中异常高表达，但ASPM在肝癌中作用研究较少[3-4]。本研究分析ASPM对肝癌细胞恶性表型的影响，为临床对肝癌诊断和治疗提供新的理论依据及靶向策略。

1 资料与方法

1.1细胞系与主要试剂、仪器:人肝癌细胞株 QGY-7703购自中南大学细胞中心；民海生物医学有限公司的小牛血清；Gibco公司胰蛋白酶、RPMI1640细胞培养液；PCR仪 (Sony，Japan)；美国BD公司FACS Calibur流式细胞仪；三箭生物技术有限公司的流式凋亡细胞检测试剂盒；上海邦景实业有限公司的MitoTrackerTMGreen试剂盒；Transwell小室(Costar美国)。

1.2方法

1.2.1细胞培养:将人肝癌细胞株 QGY-7703培养于RPMI1640培养液(含小牛血清10%、链霉素100 μg/ml、青霉素100 IU/ml)，放置在5%CO2、37℃培养箱中培养。每 2～3天传代1次，用0.02%EDTA配制的0.1%胰酶消化细胞。

1.2.2siRNA转染:转染前1 d取对数生长期细胞，按试剂盒说明书进行转染，于转染后的24 h、48 h及72 h收集细胞用qRT-PCR检测目的基因的沉默效率。以ASPM基因沉默的QGY-7703细胞为试验组，以转染空质粒的QGY-7703细胞为对照组。

1.2.3检测QGY-7703细胞CCK-8生存率:siRNA沉默目的基因后，于第24 h、48 h、72 h分别检测在波长450 nm处细胞的OD值，计算细胞的生长速度。

1.2.4平板克隆形成实验:siRNA沉默目的基因后，取对数生长期的细胞经PBS清洗后，加入甲醇进行固定，弃去甲醇，加入结晶紫进行染色。

1.2.5检测细胞周期:将试验组和对照组细胞用D-Hank′s 液漂洗，PI染色，流式细胞仪检测细胞周期分布情况。

1.2.6检测细胞的凋亡数量：siRNA沉默目的基因后，采用细胞凋亡检测试剂盒和MitoTrackerTMGreen试剂盒通过流式细胞术检测细胞的凋亡数量。

1.2.7Transwell小室检测细胞迁移：siRNA沉默目的基因后，分别接种于Transwell小室的上室中，上室加入无血清培基，14 h后取出上室，甲醇固定30 min，结晶紫染色30 min，流水缓慢冲洗，进行拍照，计数。观察指标：比较两组细胞生长速度、克隆形成能力、细胞周期分布、细胞凋亡比例、细胞迁移数目与侵袭数目。

1.3统计学方法：应用SPSS21.0软件进行t及χ2检验。

2 结果

2.1两组细胞生长速度和克隆形成能力对比:与对照组相比，试验组QGY-7703肝癌细胞的生长速度明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。试验组细胞克隆形成数目为(165.12±10.45)个低于对照组(264.21±12.59)个，差异有统计学意义(P<0.05)。

注：与对照组比较，①P<0.05图1 两组QGY-7703肝癌细胞生长速度

2.2两组细胞周期分布对比:试验组G1/G0期细胞比例高于对照组，S期细胞比例低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，两组G2/M期细胞比例相比差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组细胞周期分布对比

2.3两组细胞凋亡比例对比:沉默ASPM可促进QGY-7703肝癌细胞的凋亡，试验组QGY-7703的凋亡水平(8.10±0.16)%高于对照组的(0.65±0.11)%，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4两组细胞迁移数目与侵袭数目对比:试验组细胞迁移数目与侵袭数目均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 两组细胞迁移数目与侵袭数目对比个，n=3)

3 讨论

肝癌属于消化系统常见的恶性肿瘤之一，复发率较高，且5年存活率低下，预后欠佳[5]。癌细胞转移、浸润是肝癌复发与预后不佳的主要因素[6]，针对肝癌侵袭转移一直是临床研究的热点。肿瘤干细胞能够无限增殖、自我更新，进而诱发肿瘤，同时其生长周期较慢，可逃避化疗、放疗药物作用。而目前临床治疗靶细胞为快速复制的细胞，对于此类生长周期较慢的细胞靶向攻击能力欠佳，治疗期间此类细胞易潜伏，成为日后患者复发和转移的根源[7-8]。

ASPM属于人类同源蛋白，分布于细胞有丝分裂期的纺锤体两极和细胞周期间期的中心体，参与调控纺锤体生成和细胞周期中心体，促使细胞增殖，并可调节细胞质分裂和有丝分裂方向，是一项干细胞标志物[9]。ASPM在癌细胞中高表达，其表达随着细胞分化程度增高而下调，降低ASPM表达能够抑制细胞的增殖能力与自我更新。本研究提示沉默ASPM基因可抑制QGY-7703的增殖能力和克隆形成能力、迁移能力，促使G1期细胞增加及S期细胞减少，加速QGY-7703凋亡。当ASPM发生突变，会影响其编码的蛋白功能，造成中间体功能发生缺陷，影响染色体分离，出现异倍体，诱发肿瘤，与肿瘤侵袭、转移、复发等因素密切相关。