王雪峰 ，刘文畅 ，樊利鹏，谭洪新，罗国芝 ，孙大川

(1 上海海洋大学上海水产养殖工程技术研究中心，上海 201306；2 上海市水产动物良种创制与绿色养殖协同创新中心，上海 201306；3 江苏省沿海开发(东台)有限公司，江苏东台 224200)

2020年，中国沿海养殖池塘面积达9 613.66 km2，水产养殖已成为沿海地区土地复垦的重要途径之一[1]。然而，沿海水产养殖一直是重要的陆源海洋污染物的输入源，会导致沿海地下水富营养化[2]。除氮、磷等常见的污染物外，pH在沿海水产养殖中同样需要关注。全国各级养殖尾水排放标准均要求池塘尾水的pH应小于9，超标的尾水须经处理达标后方可排放[3-4]。李云梦等[5]研究发现，滨海围垦滩涂养殖池塘中的pH最高可达9.8。高pH除了是导致该池塘凡纳滨对虾高死亡率的原因外，亦无法满足尾水的排放要求。人工湿地因综合高效的处理能力在养殖尾水的处理中被重视[6]，但研究者却很少强调其有效的降pH效果。倘若人工湿地可以兼具降低pH和去除污染物的效果，那么将进一步丰富高pH水体的处理方式，并促进人工湿地在沿海养殖中的应用。

填料是人工湿地特别是潜流人工湿地床体的主要介质，对湿地的污染物去除效果具有决定性影响[7]。石灰石、沸石等天然材料因具有官能团作用、特异性吸附位点等特殊性质而被广泛应用[8]。风化煤是暴露在地表或位于地表浅层的煤，内含大量的再生腐殖酸和羧基、羟基等含活性基团。由于大分子腐殖酸可以通过酸碱中和和交换作用降低土壤pH，因此风化煤被广泛应用于盐碱地的土壤改良[9]。作为一种喜盐耐碱的盐生作物，碱蓬(Suaedasalsa)既能修复含盐水体，又具有较好的经济价值[10]。

本研究将碱蓬作为净化植物，结合风化煤、陶瓷环和石英砂构建组合填料人工湿地，以期在去除氮、磷等污染物的同时，同步降低水体pH，从而为人工湿地在养殖尾水中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 人工湿地的构建

人工湿地共设3组作为重复，由敞口透明的有机玻璃柱构建而成(图1)。采用圆锥体和圆柱体的复合结构，上部为圆柱体容器，直径40 cm、高100 cm，下部为圆锥体容器，直径40 cm、高10 cm。圆锥体的最下端开口连接排水管，排水管上依次固定出水阀门和流量计，用以调控湿地的实际出水流量。在距填料层表面约3 cm的容器侧面增设一出水管，湿地多余的进水经此排出。湿地由下到上依次填充石英砂、陶瓷环和风化煤。石英砂粒径8～16 mm，填满整个圆锥体以及(13.50±1.22)cm高的圆柱体。陶瓷环为六角状，由中性石英粉烧制而成，粒径15～20 mm，实际填充高度(31.67±2.59)cm。风化煤大小不均，粒径2～6 cm，填充高度(52.50±1.47)cm。在填料表层均匀栽种8株碱蓬，碱蓬根部使用水草泥包裹。水草泥为黑色的圆形颗粒，颗粒大小为2～5 mm。碱蓬均采集于条子泥垦区未经开垦的滩涂湿地(32°50′50″N，120°57′30″ E)。

图1 湿地系统的示意图Fig.1 Schematic diagram of the wetland system

1.2 人工湿地的运行

湿地搭建于江苏省条子泥垦区条南片区的一条排水渠道中(32°44′44″N，120°56′58″ E)，片区内36个12 hm2养殖池塘的尾水均经此渠道汇入黄海，水体盐度为2.7～7.1。自2021年3月11日开始，组合填料湿地共计运行70 d，水力停留时间为4.03 h，水力负荷为2.18 m3/(m2d)。

1.3 检测项目及方法

1.3.1 水质指标

收集湿地的上端进水和下端出水样本，利用便携式多参数水质测量仪(Multi 3430，德国WTW公司)测定样本pH。按照标准方法，测定总氮(TN)、总磷(TP)和高锰酸盐指数(CODMn)[11-12]。

1.3.2 碱蓬的生长指标

在人工湿地运行初始、终末分别留存碱蓬样本，利用分析天平称量鲜重，用皮尺测定株高和根长，在烘箱烘干水分后称量干重并计算含水率。

1.3.3 硝化能力测试

1.3.4 微生物群落分析

同硝化能力测试，湿地运行结束后，将不同高度的同种填料均匀混合，风化煤分为上、下两部分以区分是否有碱蓬根系覆盖。以超纯水作为洗涤剂，超声波洗涤各类填料后过0.22 μm滤膜。根据E.Z.N.A.© soil DNA kit(Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.)说明书抽提滤膜上微生物群落的总DNA，使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量，使用NanoDrop2000测定DNA质量浓度和纯度。使用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)对16S rRNA基因V3-V4可变区进行PCR扩增。扩增程序为：95 ℃预变性3 min，27个循环(95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s)，然后72 ℃稳定延伸10 min，最后在4 ℃进行保存。利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序(上海美吉生物医药科技有限公司)。

将所有序列读数聚类到操作分类单位(OTU)(相似性阈值为 97%)，使用NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)确定OTU代表性序列的分类分配。为了消除不同测序深度造成的偏差，将所有测序样本分别稀化到最低序列(36 041条)，后续分析均使用归一化的OTU丰度数据进行。

1.4 数据分析

使用SPSS 19.0软件对相关数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，显著水平取P<0.05。微生物数据在Majorbio I-Sanger云在线平台上进行分析。

2 结果与分析

2.1 人工湿地的运行

人工湿地进、出水中的污染物质量浓度和去除率如图2所示。垦区池塘尾水中的pH、TN、TP和CODMn分别在8.55～9.17、3.58～8.53 mg/L、0.47～1.16 mg/L和17.96～26.63 mg/L的范围内波动。经湿地净化后，出水中的pH、TN、TP和CODMn分别为7.34～8.79、2.75～6.65 mg/L、0.33～0.71 mg/L和16.32～24.16 mg/L。其中，pH、TP和CODMn在进、出水中的差异显著(P<0.05)。进水的pH下降5.27%～17.83%，平均下降8.78%。出水中pH除有2次达8.56以上外，均小于8.50。首次采样时，出水中的TN高于进水，即TN去除率表现为负值。其余时间里，湿地的TN去除率维持在15.92%～43.80%范围,平均值为27.22%。TN去除率随进水质量浓度上下波动，当进水中的TN高于7 mg/L时，出水中的TN并不能保持在5 mg/L以下。湿地的TP去除率在10.37%～47.76%范围，随运行时间增加而不断增长，平均去除率36.26%。在第29天，湿地进水中的TP仅为0.50 mg/L，远低于其他时段，此时TP的去除率仅为10.37%。经湿地净化后，出水中的TP全部低于1 mg/L，并在多数情况下低于0.5 mg/L。前2次采样时，湿地的CODMn去除率不足5%，后逐渐升高并维持在9.16%～25.53%，平均值为13.52%。经湿地净化后，出水中的CODMn维持在15～25 mg/L范围。

图2 进出水中的pH、总氮(TN)、总磷(TP)和高锰酸盐指数(CODMn)及去除率的变化Fig.2 Variation of pH,TN,TP,and CODMn and removal rates in influent and effluent

2.2 碱蓬的生长

人工湿地运转结束后，碱蓬的鲜重、干重、株高、根系长度和含水率均出现了显著增长(P<0.05)。运转结束时，碱蓬的平均根系长度为(19.17±7.77)cm，接近风化煤层高度的1/2。

表1 人工湿地运行前后碱蓬的生长指标Tab.1 Growth indicators of Suaeda salsa before and after the artificial wetland operation

2.3 硝化能力测试

图3 硝化能力测试中和的质量浓度变化Fig.3 Changes of in the nitrification capacity test

2.4 细菌群落的α和β多样性

如表2所示，各样本文库覆盖率(Coverage)均大于0.99，说明测序结果可以很好地反映样本的真实情况。选取Ace和Chao指数估算细菌群落的丰富度，选取Shannon和Simpson指数估算细菌群落的多样性。尽管差异不显著，但Ace、Chao和Simpson指数均显示上层风化煤中细菌群落的丰富度和多样性最高。Shannon指数显示上层风化煤和石英砂上细菌群落的多样性显著高于陶瓷环(P<0.05)。

表2 不同填料上细菌群落的α多样性指数Tab.2 Alpha diversity index of bacterial communities on different fillers

使用主坐标分析(PCoA)在OUT水平展示细菌群落的β多样性(图4)。

图4 不同填料上细菌群落组成的 主坐标分析 (PCoA)Fig.4 Principal coordinate analysis (PCoA) of bacterialcommunity composition on different fillers

不同填料上的细菌群落样本各自聚集，上、下层风化煤间的距离接近。ANOSIM相似性分析表明，不同填料上的细菌群落组成存在显著差异(P<0.05)。

2.5 细菌群落的组成和差异

为了减少群落的复杂性和冗余性，将相对丰度低于1%的群落都归为稀有种，并为“Others”。不同填料上细菌群落在门水平的组成如图5所示，共有15类菌门的相对丰度超过1%。其中，变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidota)、绿弯菌门(Chloroflexi)和蓝细菌门(Cyanobacteria)在湿地中的平均相对丰度超过10%。变形菌门的丰度最高，在所有填料上的相对丰度均超过20%。石英砂上拟杆菌门和陶瓷环上绿弯菌门的相对丰度也达20%以上，厚壁菌门(Firmicutes)在下层风化煤上的丰度达10%以上。方差分析表明，在上述菌门中，仅有拟杆菌门在不同填料上的相对丰度存在显著差异(P<0.05)，其在石英砂上显著富集(图6)。

图5 不同填料上细菌群落门水平上的组成Fig.5 Bacteria community structures on different fillers at the phylum level

图6 不同填料上优势菌门间的丰度差异Fig.6 Differences in the abundance of dominant phyla on different fillers

图7显示了湿地中相对丰度大于1%的菌属。有3类菌属的平均相对丰度大于3%，分别为蓝菌属(Cyanobium_PCC-6307)(6.84%)、norank_f_ _A4b(5.30%)和芽孢杆菌属(Bacillus)(3.20%)。除此之外，norank_f_ _Microscillaceae和unclassified_f_ _Chloroflexaceae在上层风化煤中的相对丰度达3.82%和3.52%，下层风化煤中短芽孢杆菌属(Brevibacillus)的丰度达4.55%。方差分析表明，上述菌属中，仅有norank_f_ _Microscillaceae在不同填料上的相对丰度存在显著差异(P<0.05)，其在上层风化煤中显著富集(图8)。

图7 不同填料上细菌群落属水平上的组成Fig.7 Bacteria community structures on different fillers at the genus level

图8 不同填料上优势菌属间的丰度差异Fig.8 Differences in the abundance of dominant genus on different fillers

3 讨论

3.1 湿地的运行效果

江苏省《池塘养殖尾水排放标准》中将养殖尾水受纳水域分为海水、淡水两种，标准级别定为一级和二级两类[4]。其中，海水受纳水域的限定指标不包含CODMn，用淡水受纳水域的限定值代替。参照标准，条子泥垦区尾水中pH、TN、TP和CODMn分别超出二级排放标准5、3、3和4次。除TP有2次满足外，其他指标均不满足一级排放标准。经组合湿地净化后，仅TN存在2次超标现象，pH、TP和CODMn全部满足二级排放标准。其中，pH除2次高于8.50外，均满足一级排放标准。因此，组合填料湿地对于垦区养殖尾水，尤其是对水体pH的调控具有实际意义。

组合填料湿地对于TN、TP和CODMn的去除率分别为15.92%～43.80%、10.37%～47.76%和2.56%～25.53%，平均去除率为27.22%、36.26%和13.52%，TN在进、出水中的差异不显著。杨新萍等[13]在野外以芦苇砾石床构建的水平潜流湿地，对于微污染河道水体TN和CODMn的去除率分别为6.10%～37.83%和12.66%～37.03%，净化效果与本研究近似。然而，秦怡[14]通过将不同填料和植物进行组合，发现潜流湿地对于河水中TN、TP和CODMn的平均去除率高达52.99%、67.98%和44.51%。隗岚琳等[15]研究发现，低温条件下30 d内组合填料垂直潜流湿地对污水处理厂尾水中TN和TP的平均去除率仍可达38.5%和26.8%。比较而言，本研究中组合填料湿地的去除率较低，可能与多种因素有关。一方面，作为核心填料，风化煤的粒径远超过陶粒、砾石等常见填料(3～15 mm)[16]。粒径大小是影响湿地净化效果的指标之一，因为相同体积的小粒径填料具有更大的比表面积，能够提供更多的物理和化学反应位点[17]。另一方面，湿地的污染物去除率与进水浓度相关[18]。同比于城市生活污水和工业废水，养殖尾水中的污染物含量更低，处理难度更大[6]。与此同时，组合填料湿地搭建于野外，容易受到天气、温度等环境因素变化的影响。

3.2 碱蓬的生长和填料的性能

3.3 细菌群落结构

门水平上，将相对丰度高于10%的菌门作为优势菌[22]，则变形菌门、拟杆菌门、绿弯菌门和蓝细菌门为湿地中的优势菌门。变形菌门的丰度最高，其含有丰富的反硝化菌属，对于系统中TN的去除起主要作用[23]。拟杆菌门中的大多细菌对有机物具有降解作用，是人工湿地中常见的菌群[24]。相对于陶瓷环和风化煤，石英砂更有利于拟杆菌门的富集。属水平上，将相对丰度高于3%的菌属作为优势菌，则湿地中的优势菌属包括蓝菌属、norank_f_ _A4b和芽孢杆菌属。蓝菌属为蓝细菌中的一类，其在蓝藻水华中常作为优势类别出现[25]。然而，蓝菌属在人工湿地中并不常具有较高丰度[26-27]。在组合湿地运转时，河道水体蓝菌属的富集可能直接影响了湿地中蓝菌属的丰度。norank_f_ _A4b和芽孢杆菌属在脱氨系统中经常出现，可参与大分子有机物的降解和反硝化过程[28-29]，它们在湿地中的富集有利于水中氮和有机质的去除。已有研究发现，Microscillaceae科的细菌在好氧膜生物反应器中占据主导地位，并与有机污染物的变化呈正相关[30]。尽管无法确定准确的分类信息，但norank_f_ _Microscillaceae的富集可能会直接提高上层风化煤的净水能力。

4 结论

在70 d的运行中，以碱蓬、风化煤、陶瓷环和石英砂新建的组合填料垂直潜流湿地系统表现出长期稳定的降pH效果。受粒径大小、进水浓度等因素的影响，湿地对于条子泥垦区池塘养殖尾水的TN、TP和CODMn的平均去除率较低，分别为27.22%、36.26%和13.52%。养殖尾水经净化后基本满足江苏省池塘养殖尾水排放二级标准，pH基本满足一级标准。这表明组合填料湿地对于养殖尾水，尤其是对水体pH的调控具有实际意义。运行结束后，湿地中不同填料的去TAN效果和微生物群落结构不同。风化煤作为湿地填料具有应用价值，但需要确定合适的粒径大小。

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