郝 艳，安明燕，张岱琳，张立彬，肖 啸，武军凯

(河北科技师范学院园艺科技学院，河北 秦皇岛，066600)

我国桃[Prunuspersica(L.) Batsch]品种育种资源较为丰富，种植面积广泛，为解决花期不遇和异地杂交问题，在桃育种上多选用人工授粉或杂交授粉。桃花粉的寿命很短，一旦离开植株后在自然环境中存活时间短[1]。因此，如何保存花粉成为许多研究者关注的焦点。对水稻、玉米、大豆、白杏、苹果和软枣猕猴桃[2～7]研究发现，高温贮藏会使花粉萌发率显著下降，并且可能会出现畸形花粉[8]。对花粉进行低温或超低温保存，不仅可以解决不同花期的授粉问题，便于不同地区种质资源交换，对遗传育种具有重要意义。笔者选用久脆和久红等2个桃品种花粉，对不同贮藏温度下的花粉萌发率进行试验，以期筛选出最佳的桃花粉贮藏条件。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验以昌黎县石桥营桃园内的久脆、久红等2个品种为试验材料。取大蕾期的完整花朵50朵，剥落花药，取合格的花药放入装有石腊纸的培养皿，于室内晾制。待完全散粉后，收集花粉，作为花粉贮藏试验的材料。在花药选取过程中，每个品种选取30枚花药作为花粉量测定的试验样本。将收集的每个品种的桃花粉分别加入到4个2 mL的离心管内密封贮藏。设置4个处理：-80 ℃，-20 ℃，4 ℃，室温。各处理条件下的花粉间隔0，10，20，30，180 d进行花粉萌发率测定。

1.2 试验方法

1.2.1花粉萌发率和花粉管长度的测定 本次试验对两个桃品种进行花粉萌发率的测定采用离体萌发法。配置固体培养基(配方为8 g·L-1琼脂+50 mg·L-1硼酸+200 g·L-1蔗糖)，待固体培养基冷凝后，在超净工作台上用不同的牙签分别蘸取-80 ℃，-20 ℃，4 ℃，室温等4个温度下贮藏的花粉，并在培养基上方轻轻抖动牙签，使蘸取的花粉均匀的铺在培养基表面，做好标记。将培养皿放置到25 ℃的培养箱中，分别于30，60，90，120，180 min后观察花粉的萌发情况。对每个离体培养的花粉培养基用倒置显微镜进行观察，分别选取3个区域(选取标准为该区域的花粉粒不少于20粒)进行观察，记录每个区域内的花粉粒萌发数(判定标准为花粉管长度超过花粉粒直径的1/2)和总数。用测微尺测量长度来统计每个品种花粉管的平均长度，以此观察花粉萌发和花粉管伸长的情况。

1.2.2花粉量的测定 本次试验对2个不同桃品种花粉量的测定采用计数板计数法。每个品种选取30枚花药放到无菌的10 mL离心管底部。将离心管置于50 ℃的烘箱中烘干，至每个花药开裂，花粉完全散出。加入20%的六偏磷酸钠溶液，定容到6 mL充分混匀，移液器吸取2 μL的悬浮液滴在血细胞计数板上。用显微镜(10×40倍)对每个处理随机选取3个视野进行花粉量的计数，3次重复，计算平均值。

花粉量=(80个小格内的花粉数/80)×血细胞计数板小格总个数×稀释倍数×10 000

1.2.3花粉活力的测定 本次试验对2个桃品种当天采集花粉进行花粉活力的测定采用FDA染色法。配制FDA-buffer：1 μL FDA母液+1 mL BK bufferS15MOPS pH 7.5。用体积分数75%酒精清洗载玻片，然后滴1滴配置好的FDA-buffer，加花粉到液滴中，盖上盖玻片，室温静置5 min。在蓝光光学显微镜(100倍)下观察花粉活力，若发出荧光则表示花粉有活力。

1.3 数据处理

本次试验通过Excel和GraphPad软件进行试验数据的统计和处理。

2 结果与分析

2.1 久红、久脆桃品种的单花药花粉量统计分析

对久红、久脆等2个桃品种进行花粉量测定。统计结果显示，久红和久脆等2品种花粉量接近，久红平均单花药花粉量为2 813个，久脆为2 696个，均在2 532～2 930之间。

2.2 不同贮藏条件对久红、久脆桃花粉萌发率的影响

在不同贮藏温度条件下，久红和久脆花粉的萌发率随着贮藏时间的延长均呈下降趋势(图1)。久红花粉在室温条件下贮藏10 d时，其萌发率较其他3个贮藏温度条件下的萌发率下降显著，由最初的82%下降到51%；贮藏10～30 d时，其花粉萌发率下降趋势则表现缓和，由51%下降到37%。贮藏180 d时，各贮藏温度下的花粉萌发率均明显下降至几乎为0。然而，在4 ℃条件下贮藏10 d时，久脆的花粉萌发率出现明显下降，由最初的84%下降到64%；贮藏10～20 d时，花粉萌发率变化不明显；贮藏20～30 d时，花粉萌发率再次出现明显下降，由67%下降至33%。与此同时，在室温条件下贮藏的久脆花粉，在贮藏10 d时花粉萌发率也出现明显下降，由最初的82%下降到42%；贮藏10～20 d时花粉萌发率变化趋势缓和；贮藏20～30 d时花粉萌发率显著下降，由48%下降到25%。贮藏180 d时各贮藏温度下的花粉萌发率均明显下降至近乎为0(图1)。

注：A：久红；B：久脆图1 不同贮藏条件对久红、久脆桃花粉萌发率的影响

2.3 不同贮藏条件对久红、久脆桃花粉管长度的影响

久红和久脆的花粉在培养时间为30，60，90，120，180 min时，花粉管长度逐渐增长，在培养180 min时，花粉管达到最长。新采集花粉管长度在5 865～6 546 μm范围内。贮藏时间在20 d时，久红和久脆花粉管长度均可以保持在3 368～5 658 μm范围内，但不同贮藏温度条件下的花粉管长度具有显著差异，室温贮藏和-80 ℃贮藏条件下的花粉管长度最多相差1 579 μm。贮藏30 d时，花粉管长度明显下降到693～1 266 μm(图2和图3)，在-80 ℃，-20 ℃，4 ℃，室温各贮藏温度条件下，花粉管的长度随着花粉贮藏时间的延长总体下降，由0 d时的5 865～6 546 μm下降到180 d时的0 μm(图4)。

2.4 久红、久脆桃花粉生活力的最佳贮藏条件分析

久红和久脆花粉贮藏时间为20 d以内，在-80 ℃，-20 ℃，4 ℃，室温等贮藏条件下，花粉的萌发率均在42.4%以上(表1)。其中，在-80 ℃下贮藏的花粉萌发率最高，在68.6% 以上。花粉管长度均在3 368 μm以上。而贮藏30 d时，久红花粉在室温条件下贮藏萌发率最低，为34.2%；而久脆花粉在室温条件下贮藏萌发率最低，为25.0%。二者花粉管生长长度下降到693～1 266 μm。当花粉贮藏180 d时，花粉萌发率降到较低水平，最高萌发率仅有4.4%，而花粉管长度也下降到80 μm以下。基于此，笔者认为贮藏30 d时久红和久脆花粉能够较好的维持花粉萌发率且贮藏温度越低维持效果越好。

2.5 久红、久脆桃花粉活力FDA染色

为了验证花粉活力，对久红和久脆的花粉粒进行了FDA染色。具有活力的花粉能被醋酸荧光素(FDA)染色，可在显微镜下观察到荧光色，试验结果显示，久脆和久红的花粉粒均观察到了明显荧光色(图5)，说明久红和久脆的花粉是可育的。

图2 不同贮藏温度和培养时间对久红花粉管长度的影响

图3 不同贮藏温度和培养时间对久脆花粉管长度的影响

注：A，久红；B，久脆图4 不同贮藏条件对久红、久脆桃花粉管长度的影响

表1 不同贮藏条件下2种桃花粉相关数据汇总

注：A，久脆；B，久红图5 久脆和久红桃花粉育性观察

3 结论与讨论

桃花粉量和萌发率研究对于桃授粉与育种有重要意义。影响桃花粉量、萌发率以及育性的因素有很多，主要包括品种、环境、气候、温度和贮藏时间等。徐坤[8]对梨花粉、兰旭等[2]对水稻花粉、陈康玉等[5]对香白杏花粉、李仁浩等[7]对软枣猕猴桃花粉均进行了相关研究。结果表明，不同种类的植物花粉量和花粉萌发率差异较大，这与遗传基因不同有密切关系。本次试验主要对久红、久脆等2个桃品种的花粉量和萌发率进行了重点研究，并测定了在不同贮藏时间和贮藏温度下花粉管长度和萌发率的变化情况。结果显示，久红和久脆花粉量接近，在2 532～2 930范围内，最大值2 930个，低于六灶特晚、大观3号、黄水蜜、离核蟠等几个品种的花粉量[9]，这可能是由于品种的遗传特性所致，同时可能与不同日照时间，以及土壤环境密切相关。本次试验结果表明，久脆和久红花粉萌发率随着贮藏时间的延长整体呈下降趋势，这与郭瑞等[10]在其他桃品种上以及张庆等[11]在牡丹上的研究结果一致。而蔡坚等[12]在油茶花粉贮藏条件的研究中显示，油茶花粉在-20 ℃条件下贮藏0～150 d花粉萌发率无明显变化，150 d时萌发率仍保持在55% 以上，而本次试验结果显示久脆和久红的花粉在-20 ℃条件下贮藏，随着贮藏时间的延长花粉萌发率逐渐下降，贮藏180 d时萌发率基本降为0，这表明不同物种之间花粉萌发率存在显著差异。与此同时，在相同萌发时间内，花粉管的长度也随着贮藏时间的延长而逐渐减小。久红花粉在室温贮藏10～20 d时，花粉管长度明显下降，而在其他贮藏温度下贮藏20 d之后，花粉管长度出现显著下降；久脆花粉贮藏20 d之后花粉管长度也显著下降。

低温贮藏有利于大多数植物花粉萌发率的保持，且在干燥条件下，温度越低贮藏时间越长[13]。本次试验结果显示，在-80 ℃，-20 ℃，4 ℃和室温等4个温度下贮藏的花粉，随着贮藏时间的延长温度越低花粉萌发率下降越慢。曲柏宏等[14]对梨花粉进行低温保存并进行授粉试验，结果表明，冷冻条件下贮藏1年的花粉座果率与对照无显著差异,授粉能力很强；而冷藏条件下贮藏1年的花粉座果率均显著低于对照，但也有一定的授粉能力。本次试验未对贮藏后的花粉进行授粉试验，不同贮藏条件下贮藏的桃花粉是否具有授粉结实能力还有待进一步研究。