何欣，张燕a，孟慧，魏建和，吕菲菲，刘培卫，李浩凌，陈波，黄良明，杨云*

1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所 中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室/濒危药材繁育国家工程实验室，北京 100193；2.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所 海南分所 海南省南药资源保护与开发重点实验室/国家中医药管理局沉香可持续利用重点研究室，海南 海口 570311

沉香属（AquilariaLam.）植物是一类具有极高价值的非木材资源类树种，主要以其受伤害后形成的树脂而闻名，这种含有芳香树脂的木材被称为沉香[1-2]。沉香使用历史悠久，不仅在中国作为传统名贵药材及工艺品使用，还常在中东及欧美地区被作为香料[3-5]。沉香的形成需要受到外界伤害，且需要长时间积累[6]。由于近年来国际市场对沉香的需求越来越大，滥砍、滥伐现象频生，野生资源再生困难，使沉香自然种群濒临灭绝[7-8]。目前，所有的沉香属及拟沉香属（Gyrinopsspp.）物种均已被列为濒危物种[9]。

随着野生资源的濒危，现有沉香资源已无法满足人们的需求。为解决市场高品质沉香短缺问题、更好地保护沉香濒危野生物种，许多亚洲国家开始大面积种植沉香树。此外，多种人工诱导技术被开发用于生产沉香。除传统的砍伤[10]、钻孔[11]、火烙[12]、打钉[13]等方法外，人工结菌法[14]、栽培沉香试剂盒（CA-kit）法[15]及输液法通体结香技术（Agar-WIT）[16-17]等也被应用于沉香生产。Agar-WIT 是目前中国及其他产沉香的国家应用最广泛的人工诱导技术，已应用于中国及东南亚国家超过45 万株沉香树[18]。其具体方法为在距地面50 cm高的白木香树树干上钻孔，孔深达木质部，通过输液装置将结香液输入到小孔中，借助树体的蒸腾作用将安全高效的结香液输送至植株的各个部位，经6～12 个月处理后，即可在树干中形成沉香，而后整树伐倒收集沉香[19]。与自然结香和传统的人工结香方式相比，该技术具有产量高、成本低、操作简便的优势[20-21]。

近年来，Agar-WIT 被广泛应用于许多国家的沉香生产，本研究通过对Agar-WIT 处理30 d内沉香形成过程进行动态监测，从性状、显微结构、浸出物、特征图谱及沉香四醇含量测定方面分析沉香形成规律，揭示Agar-WIT 运用早期植物体内发生的结构、物质变化规律，将有助于指导沉香的采收和高效生产，并为Agar-WIT 的推广应用和技术升级提供参考。

1 材料

1.1 样品

选择中国医学科学院药用植物研究所海南分所兴隆研发基地3 年生白木香，Agar-WIT 处理结香，结香处理第1天起从输液孔上1 m处每天向下截取厚度为3 cm 的树段，持续收集结香样品30 d。每次3株平行取样设为1 个实验组，空白对照组为未经任何处理的健康白木香样品。凭证标本保存于中国医学科学院药用植物研究所海南分所沉香鉴定中心标本馆。

1.2 仪器

ECLIPSE80i 型生物显微镜（日本尼康株式会社）；7890A-5975C 型气相色谱质谱联用（GC-MS）仪（美国Agilent 公司）；2695/2475 型高效液相色谱（HPLC）仪［沃特世科技（上海）有限公司］；HH-6 型电热恒温水浴锅（江苏科技仪器有限公司）；AL104-IC 型电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；Mili-Q 型纯水仪（美国Millipore公司）；CM1950 型冰冻切片机（德国Leica 公司）；SB25-12DTDN 型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.3 试药

沉香四醇对照品（批号：111980-201904，纯度：98.6%）、沉香对照药材（批号：121222-201203）均购于中国食品药品检定研究院；乙腈为HPLC级；95%乙醇、无水乙醇、乙醚、水合氯醛等均为分析级；GF254薄层色谱板（批号：HX69349529，德国Merck公司）。

2 方法

2.1 样品前处理

砍断的沉香树段去掉枝叶及外皮，干燥后剪成约0.5 cm 的方形小块用于后续显微观察，另取沉香树段按海南省地方标准《白木香通体结香树木剖香技术规程》（DB45/T 257—2013）[22]要求，剖取沉香，剪成香片后打粉，分别过二号筛和三号筛，备用。

结香层认定标准为宏观上出现黄棕色环形沉香层；显微观察到木间韧皮部和射线细胞有黄棕色树脂[23]；薄层色谱出现与对照药材对应的条带。

2.2 沉香结香率计算

结香处理后的沉香树段截为3 段，每段上切取厚度为1 cm 的茎段。正上方分别拍取3 个茎段下截面横截面图，利用Photoshop像素法算出每株树的横截面平均像素（NC）和结香区域平均像素（NA），结香层面积（SA）与横截面面积（SC）之比等于结香区域与横截面像素数之比。每株树的结香率按公式（1）计算。

本研究中结香材料皆为胸径树龄相似的笔直单杆白木香树，假设每棵树的树干为上下均等的标准圆柱体，且每棵树树干的结香率整体保持一致。

2.3 显微鉴别

将沉香样品（包含白木层、沉香层和腐烂层）剪成方形小块，置于包埋盒中，70 ℃热水浴浸泡6 h 至沉香样品块完全软化。冷冻切片机切取50 μm左右的薄片，放入水合氯醛透化剂中透化8 h，装片，置于显微镜下观察。

2.4 薄层鉴别

称取沉香样品粉末（过二号筛）0.5 g，乙醚30 mL 提取，超声处理1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加三氯甲烷2 mL 溶解，作为供试品溶液。另取沉香对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。参照《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020年版薄层色谱法（通则0502）[24]，吸取上述2 种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，在三氯甲烷-乙醚（10∶1）条件下展开，取出后晾干，置紫外灯（365 nm）下检视。

2.5 特征图谱和沉香四醇含量测定

按照《中国药典》2020 年版方法[24]测定特征图谱和沉香四醇含量。

标准曲线绘制：称取沉香四醇对照品适量，精密称定，加无水乙醇分别制成质量浓度为0.2、0.4、1.0、2.0、8.0、12.0、16.0、20.0 μg·mL-1的溶液，再用0.22 μm 微孔滤膜滤过，即得。以峰面积（Y）对沉香四醇质量浓度（X）进行线性回归，绘制标准曲线。

2.6 GC-MS检测

样品溶液制备：称取沉香粉碎样品和健康白木香粉碎样品各0.5 g，置50 mL 锥形瓶中，加入乙醚8 mL 冰浴超声处理3 次（功率250 W，频率40 kHz），每次0.5 h，静置5 min，0.22 μm 微孔滤膜滤过，合并3 次滤液，室温下挥干，乙醚2 mL 溶解，即得。

GC-MS 条件：色谱柱为HP-5MS 5% Phenyl Silox 毛细管柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；初始柱温60 ℃，保持2 min；4 ℃·min-1升至250 ℃。进样口温度240 ℃；载气为氦气；流速为1 mL·min-1；分流比为20∶1；溶剂延迟4 min；电子轰击（EI）离子源温度为230 ℃；四级杆温度为150 ℃；接口温度为260 ℃；质量扫描范围m/z40～300。

通过MSD 工作站，结合NIST11 标准谱库对总离子流图进行分析和检索，确定沉香提取物各组分成分。

3 结果

3.1 性状

未经伤害处理的白木香树横截面颜色为乳白色。经Agar-WIT 处理30 d，白木香横截面出现明显颜色变化（图1）。由外至内可划分为白木层、过渡层、沉香层和腐烂层。处理第4～5 天可观察到1 圈浅棕色的沉香层，且颜色随处理时间延长而逐渐加深，厚度也随之增加，处理第9 天可在沉香层内侧观察到腐烂层，且腐烂层在30 d 内逐渐充满沉香层内部空间，说明Agar-WIT 处理30 d可形成明显的沉香层结构。

图1 Agar-WIT处理30 d所产沉香性状

3.2 结香率

Agar-WIT 处理30 d，沉香的平均结香率为8.04%，总体呈波动上升趋势。观察发现处理第4～5 天和第28～30 天时结香率均呈现显著上升趋势。其中，第4～5 天的结香率由4.31%急剧上升至8.11%（图2）。

图2 Agar-WIT处理30 d所产沉香的结香率（n=3）

3.3 显微特征

观察Agar-WIT 处理1～30 d 沉香横切面显微特征发现，Agar-WIT 处理第4 天在木间韧皮部和射线细胞中均观察到有黄棕色树脂出现，且黄棕色树脂随处理时间延长逐渐充满木间韧皮部，颜色也随之加深，与性状观察结果相符。观察发现，处理第4天开始产生沉香，处理30 d 可形成明显的沉香层结构（图3）。

3.4 沉香的薄层色谱

如图4 所示，Agar-WIT 处理第1～4 阶段沉香样品的荧光斑点数量随处理时间延长而随之增加，结香第3阶段和第4阶段样品薄层色谱上的荧光斑点与沉香对照药材（CK）一致。

3.5 沉香四醇含量测定

处理30 d 所产沉香的沉香四醇质量分数变化见图5。处理30 d 内沉香四醇质量分数由0.001%增长至0.034%，平均质量分数为0.017%，整体呈显著上升趋势。

图5 Agar-WIT处理30 d所产沉香的沉香四醇质量分数（n=3）

3.6 特征图谱

处理30 d 内所产沉香的特征图谱见图6。其中，S1～S12 为处理第1～4 阶段的沉香样品。随着处理时间的增加，沉香的6个特征峰逐渐出现，第3阶段时所有特征峰均已显现。Agar-WIT 处理30 d 所产沉香的特征图谱与CK一致。

图6 Agar-WIT结香30 d所产沉香的特征图谱

3.7 气相色谱主要成分检识

健康白木香乙醚提取物中含有丰富的脂肪酸和烷烃（表1），而沉香挥发油中则富含倍半萜和芳香类成分[25]。Agar-WIT 处理1～30 d 所产沉香的部分化合物变化见图7。其中，芳香类成分2,4-二叔丁基苯酚和苄基丙酮分别在处理第1 天和第9 天被检测到，倍半萜类成分别香橙烯和香橙烯分别在处理第16 天和第20 天被检测到，α-檀香醇和δ-蛇床烯分别在处理第16天和第26天被检测到。

图7 Agar-WIT处理30 d所产沉香部分化学成分变化情况

表1 健康白木香中的成分

4 结果与讨论

沉香是植物抵御外界伤害的反应产物，在形成过程中，会使木质部结构发生变化，出现明显的分层，由内而外根据形态和色泽可分为腐烂层、沉香层、过渡层和白木层[26]。Agar-WIT 处理后第4 天形成环形的沉香层，腐烂层于第9 天显现于沉香层内侧，处理30 d 即可形成明显的沉香层结构，这说明Agar-WIT 能快速诱导产生沉香类物质。除此以外，沉香在形成过程中木间韧皮部还可生成1 圈屏障层，即在沉香层和过渡层之间存在阻隔层[27]。在本研究中，Agar-WIT 处理30 d 沉香样品并未见阻隔层，推测可能为伤害时间过短，木间韧皮部的薄壁细胞还未分化形成阻隔层。

健康的白木香主要含有脂肪酸类化合物，不含色酮类、倍半萜类及苄基丙酮类化合物[28]。倍半萜和色酮是沉香类物质的主要成分[29-30]，主要在木间韧皮部、导管和射线细胞中形成和积累[23]。其中，沉香的品质与挥发油类和2-(2-苯乙基)色酮的含量有关，色酮类、倍半萜、芳香族化合物的苄基丙酮则与沉香的形成机制存在一定的相关性[27-28]。Chen等[25]发现，化学法刺激所得沉香和野生沉香的挥发油成分相似，2 种沉香中均含有苄基丙酮、cubenol、愈创醇、eudesm-7(11)-en-4α-ol、α-copaen-11-ol、白木香醛，健康白木香挥发油则含有高达59.65%的棕榈酸和油酸。本研究发现，健康白木香的乙醚提取物中以棕榈酸和烷烃类成分为主，未见倍半萜和色酮类成分，这与Chen 等[25]的研究结果基本一致。本研究未从健康白木香中检测到油酸，可能与提取方法和白木香的生长年限有关。倍半萜类化合物通过甲羟戊酸途径（MVA）和脱氧木酮糖-5-磷酸途径（DXP）2 种生物途径在植物体内合成[31-33]。α-檀香醇等倍半萜在沉香结香30 d 即能被检测到，推测别香橙烯、香橙烯等倍半萜和苄基丙酮是白木香树受伤害后的初始合成产物。2,4-二叔丁基苯酚在健康白木香和伤害后的白木香中均可被检测到，说明2,4-二叔丁基苯酚是健康白木和沉香共有的成分，然而其在伤害过程中的积累和变化还有待研究。本研究中检测的α-檀香醇、苄基丙酮、δ-蛇床烯、2,4-二叔丁基苯酚等成分均为沉香挥发油的成分[25,34-38]，其中，α-檀香醇具有安定作用[39]，苄基丙酮具有镇静、止咳作用[40-41]，这些成分均可在Agar-WIT 处理30 d 的沉香中被检测到。Agar-WIT 处理1 年的沉香具有镇静、安神、止咳方面的作用[42]，说明沉香形成早期的化合物演变具有延续性，但这些化合物在沉香形成阶段的变化规律还需进一步研究。

目前，全世界野生沉香资源紧缺，已处于濒危状态，而全球对高品质沉香的需求日益增加。因此，高效、稳定的结香技术对沉香产业的发展至关重要。本研究对Agar-WIT处理30 d内沉香形成过程进行了动态监测，揭示了Agar-WIT 运用早期植物体内发生的结构、物质变化规律，表明Agar-WIT 处理30 d能够促进沉香的快速形成和稳定积累。研究结果不仅为该技术的推广应用和技术升级提供了数据支撑，也为开发更高效的结香技术提供了参考。对于沉香结香过程中的化学成分变化和积累的规律及相互作用，还需要进一步研究。