贺丹,徐峻峰

(鄂州市中心医院 神经内科，湖北 鄂州 436000)

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 建模、分组和干预

1.3 检测指标方法

1.3.1 mNSS评分 mNSS评分系统是评估大鼠脑梗死后神经功能缺损的通用标准，包括运动、感觉、反射和平衡测试[11]。mNSS分数最高为18分，分数越高，神经损伤越严重。本研究中所有mNSS评分均由同1名研究者进行。

1.3.2 梗死体积评估 使用TTC染色评估梗死体积，干预后安乐死处死大鼠，大脑被迅速收获并在-20 ℃下冷冻10 min。制作冠状切片并在37 ℃下用2% 的TTC染色10 min。使用连接到计算机的数码相机捕获图像以评估梗死体积，未染色区域被定义为梗死，使用Image J测量体积。

1.3.3 HE染色 大鼠安乐死后取出梗死边缘脑组织并在室温下用4%多聚甲醛固定6 h。用乙醇脱水(从低浓度到高浓度)后，将组织包埋在石蜡中。然后将石蜡包埋的组织切成5 μm的切片，并将这些切片固定在载玻片上。将载玻片在室温下放入苏木精中染色10 min。用自来水洗涤1～2 min后，将载玻片置于10%冰醋酸中10 s，然后置于1%氨水中，直到切片变蓝。随后用自来水清洗1～2 min后，将载玻片放入曙红中10 s。脱水后将样本置于二甲苯中2 min；重复此步骤1次。最后，用中性胶密封玻片。在倒置显微镜下观察载玻片。

1.3.5 ELISA 将梗死边缘脑组织裂解后离心(4 ℃，20 min，12 000 r·min-1)后使用移液枪小心吸取上层清液，加入抗体孵育2 h后加入显色剂，10 min后终止反应。在450 nm下检测吸光度，根据试剂盒标准曲线计算单位质量黑质组织中IL- 1β和IL- 6的量(pg·mg-1)。收集脑组织中血液，离心后收集血清，按照上述方法检测血清中IL- 9的质量浓度(pg·ml-1)。

1.3.6 流式细胞术 大鼠断头处死后取脑组织中的血液，经过密度梯度离心后获得单个淋巴细胞悬浮液，然后利用免疫磁珠收集T淋巴细胞。将所得细胞用磷酸盐缓冲液以500 μg·g-1洗涤2次，每次持续5 min。为了分析Th9细胞，将细胞收获到5 μl的无菌试管中，洗涤后加入CD4(5 μg·ml-1)和IL- 9(5 μg·ml-1)试剂在黑暗中孵育20 min进行表面标记染色。使用BD Aria II活细胞分选仪对细胞进行分析，CD4+IL- 9+为Th9细胞。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠mNSS评分比较

建模后脑梗死组和脑梗死+miR- 155抑制剂组大鼠mNSS评分均在10～13分，且组间比较差异无统计学意义(F=2.810，P=0.094)。干预后，脑梗死组和脑梗死+miR- 155抑制剂组mNSS评分均显著高于对照组(P<0.05)，且脑梗死+miR- 155抑制剂组mNSS评分显著低于脑梗死组(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠mNSS评分比较 分Tab 1 Comparison of mNSS scores of rats in each group scores

2.2 miR- 155抑制剂对脑梗死大鼠梗死体积的影响

图1 TTC染色检测miR- 155抑制剂对梗死体积的影响Fig 1 TTC staining to detect the effect of miR- 155 inhibitor on infarct volume

2.3 miR- 155抑制剂对脑梗死大鼠脑组织病理学改变的影响

对照组神经元分布均匀，细胞核结构清晰。脑梗死组的细胞核染色变深并且出现间质性水肿。脑梗死+miR- 155抑制剂组的神经元损伤和水肿情况轻于脑梗死组。见图2。

图2 HE染色检测miR- 155抑制剂对脑梗死大鼠脑组织病理学改变的影响Fig 2 HE staining to detect the effect of miR- 155 inhibitor on the pathological changes of brain tissue in rats with cerebral infarction

2.4 miR- 155抑制剂对脑梗死大鼠神经元凋亡的影响

脑梗死组凋亡指数为(28.62±2.45)，显著高于对照组(P<0.05)；脑梗死+miR- 155抑制剂组凋亡指数为(13.26±1.79)，显著低于脑梗死组(P<0.05)，但显著高于对照组(P<0.05)。见图3。

图3 TUNEL染色检测miR- 155抑制剂对脑梗死大鼠神经元凋亡的影响(×400)Fig 3 TUNEL staining to detect the effect of miR- 155 inhibitor on neuronal apoptosis in rats with cerebral infarction(×400)

2.5 miR- 155抑制剂对脑梗死大鼠脑组织炎症反应的影响

脑梗死组IL- 1β和IL- 6水平显著高于对照组(P<0.05)；脑梗死+miR- 155抑制剂组IL- 1β和IL- 6水平显著低于脑梗死组(P<0.05)，但显著高于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 ELISA检测miR- 155抑制剂对脑梗死大鼠脑组织炎症反应的影响 pg·mg-1Tab 2 ELISA to detect the effect of miR- 155 inhibitors on the inflammatory response of brain tissue in rats with cerebral infarction pg·mg-1

2.6 miR- 155抑制剂对脑梗死大鼠Th9细胞比例和I 9表达的影响

脑梗死组大鼠脑组织血液中Th9细胞比例和IL- 9浓度显著高于对照组(P<0.05)；脑梗死+miR- 155抑制剂组Th9细胞比例和IL- 9浓度显著低于脑梗死组(P<0.05)，但显著高于对照组(P<0.05)。见图4、表3。

表3 miR- 155抑制剂对脑梗死大鼠脑组织血液中Th9细胞比例和I 9表达的影响Tab 3 Effects of miR- 155 inhibitors on the proportion of Th9 cells and the expression of I 9 in the blood of cerebral infarction rats

图4 miR- 155抑制剂对脑梗死大鼠脑组织血液中Th9细胞比例的影响Fig 4 The effect of miR- 155 inhibitor on the proportion of Th9 cells in the blood of cerebral infarction rats

2.7 miR- 155抑制剂对脑梗死大鼠脑组织T淋巴细胞中miR- 155表达水平的影响

脑梗死组大鼠脑组织T淋巴细胞中miR- 155水平为(3.41±0.42)，显著高于对照组的(1.00±0.09)，差异有统计学意义(P<0.05)。脑梗死+miR- 155抑制剂组的miR- 155水平为(1.76±1.92)，显著低于脑梗死组，但显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.8 miR- 155抑制剂对脑梗死大鼠脑组织T淋巴细胞中PU.1、IRF4蛋白表达水平的影响

脑梗死组大鼠脑组织T淋巴细胞中PU.1、IRF4蛋白水平显著高于对照组(P<0.05)。脑梗死+miR- 155抑制剂组PU.1、IRF4蛋白水平显著低于脑梗死组(P<0.05)，但显著高于对照组(P<0.05)。见图5、表4。

表4 miR- 155抑制剂对脑梗死大鼠脑组织T淋巴细胞中PU.1和IRF4蛋白表达水平的影响Tab 4 The effect of miR- 155 inhibitors on the expression levels of PU.1 and IRF4 proteins in T lymphocytes in brain tissue of rats with cerebral infarction

图5 Western blotting检测miR- 155抑制剂对脑梗死大鼠脑组织T淋巴细胞中PU.1、IRF4蛋白表达水平的影响Fig 5 Western blotting detection of the effect of miR- 155 inhibitor on PU.1 and IRF4 protein expression levels in T lymphocytes of cerebral infarction rats

3 讨 论

脑梗死后血液再灌注会诱发脑水肿，在梗死发生2～7 d后导致神经元继发性损伤，诱发神经系统后遗症，并与死亡有关[12]。脑梗死预后个体差异较大，具有极高的致死率和致残率，但是目前尚无治疗脑梗死和减少后遗症的特效药物，寻找缓解缺血性脑梗死神经元损伤的方法具有重要的临床意义[13]。