CXCL1/2/10介导的免疫炎症与草酸钙结石形成的关系

2022-07-06刘文刚张光远黎明程祎吴志荣孔广发莫永轩

东南大学学报（医学版） 2022年3期

刘文刚，张光远，黎明，程祎，吴志荣，孔广发，莫永轩

(1.东莞市滨海湾中心医院泌尿外科，广东东莞 523000; 2.东南大学附属中大医院泌尿外科，江苏南京 210009)

近年来，随着结石研究的不断深入，免疫炎症在草酸钙结石形成过程中的作用机制被揭示。研究表明，在草酸钙结石形成过程中，尤其是兰德尔斑块(Randall plaques,RPs)的形成过程中往往伴随着免疫细胞的浸润，不同免疫细胞比例的分布直接影响患者斑块的形成与结石的发生[1]。Taguchi等[2]通过分析23例草酸钙结石形成者(年龄和性别匹配)的肾乳头和非乳头旁边组织及7例正常肾乳头组织之间的基因表达发现，草酸钙结石患者肾乳头的骨桥蛋白、巨噬细胞(尤其是M1型巨噬细胞)及炎症因子明显升高或增多进而导致肾损伤和氧化应激加重，另外，组织炎症细胞因子的表达会导致免疫细胞的数量和细胞凋亡水平均增加。这一研究结果表明炎症细胞因子在草酸钙结石形成过程中发挥了重要作用。本研究则基于GEO数据库进行差异表达基因(DEGs)筛选，获取草酸钙结石危险因素之一，即特发性高钙尿(idiopathic hypercalciuria，IH)SD大鼠mRNA数据，进行生物信息学分析，从中筛选关键分子并构建草酸钙结石大鼠模型，并在大鼠肾组织中验证关键基因的表达，为研究和干预草酸钙结石形成提供新的分子靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 生物信息学分析

1.2.1 数据下载与预处理从NCBI基因数据库中筛选出IH大鼠数据集(GES75542)进行后续分析。首先对GEO数据集进行预处理和归一化，然后用Limma R软件包进行DEGs分析。倍数变化(FC)>2和校正P值(Padj.)<0.05作为DEGs筛查的临界值。

1.2.2 GO与KEGG功能富集分析 GO分析对基因进行简单的注释，具体分为3个方面，即细胞生物进程(biological process，BP)、细胞组成(cellular component，CC)及分子功能(molecular function，MF)。KEGG则可进一步获得基因参与的主要功能和代谢通路。本研究利用Metascape(http:∥metascape.org/)数据库[3]进行GO与KEGG功能富集分析，并对富集最显著的前20位通路进行可视化分析。

1.3 构建草酸钙结石大鼠模型

将20只SD雄性大鼠随机分为两组，即造模组(10只)和空白对照组(10只)。建模方法：第1周和第3周的前3天，灌胃1%氯化铵2 ml,且给予1%乙二醇饮用水饲喂。空白对照组：第1周和第3周的前3天，灌胃盐水2 ml,并给予正常饮用水饲喂。4周后处死大鼠，并收集肾脏组织，进行切片染色等。

1.4 免疫组化实验

按照免疫组化试剂盒说明书进行实验，孵育不同抗体进行检测，显微镜下观察组织存在棕黄色或棕褐色则为表达阳性，颜色深浅程度反映蛋白表达水平的强弱。以 PBS 取代一抗为阴性对照，实验结果评价由2名研究者单独评分完成。

1.5 统计学处理

所有实验均重复3次，数据以平均值±标准差来表示。采用 SPSS 16.0 统计软件进行数据分析，两组间差异采用t检验进行比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GSE75542数据集筛选出195差异表达基因

首先将GSE75542测序数据以热图的形式进行展示(图1A)，接着对数据进行预处理与归一化，减少测序误差(图1B)；利用Limma R软件包进行DEGs分析，共筛选出146个上调的基因，49个下调的基因(P<0.05, log2FC<-1或log2FC>1)(图1C)。

A.GSE75542数据热图;B.数据集的预处理；C.DEGs的火山图(P<0.05, log2FC<-1 或 log2FC>1)图1 GSE75542数据集中筛选DEGs

2.2 功能富集分析及PPI蛋白互作筛选关键蛋白

在Metascapes数据库中对195个DEGs进行GO与KEGG的功能富集分析，并将富集在前20位的通路进行可视化(图2A)。结果显示，基因富集在GO:0032496:对脂多糖的反应、GO:0010942：细胞死亡的正调控、GO:0002544:慢性炎症反应、GO:0006954：炎症反应、GO:0072593：活性氧代谢过程等代谢通路中；进一步分析各基因分布在具体通路中(图2B)。对195个基因进行PPI蛋白互作分析结果(图3A)显示，score>20的基因共有10个，结合其基因功能，选定CXCL1、CXCL2、CXCL10、IL6、IL1B作为关键基因进行后续的实验验证(图3B)。