姜林娟，郑 志,2，朱绍辉，侯 栋，朴丙熙，许旭黎,權英珠

(1．新乡医学院公共卫生学院卫生毒理学教研室,河南 新乡 453003；2.韩陵医药研究院有限公司,江苏 南京 211100；3.新乡医学院第一附属医院普通外科,河南 卫辉 453100；4.莱帕坚公司,韩国 首尔 04393；5.梨花女子大学药学院，韩国 首尔 04393)

医院病原微生物感染严重威胁住院患者的健康和生命，也影响医院对患者的治疗和护理质量，已成为重要的社会公共卫生问题之一。目前，医院致病病原菌防治的最大难题是病原菌对抗菌药物的耐药，且由交叉感染导致的医院病房病原菌污染情况更加复杂。因此，医院病原微生物的感染防控一直是预防医学领域的主要研究方向。益生菌是对机体健康有益的微生物，具有调节肠道菌群、释放抗菌物质、抑制致病病原菌生长、抗炎以及提高机体免疫力的作用[1-3]。有研究报道，通过发酵活化的益生菌具有耐药性小、不良反应小和安全性高的特点，在临床病原菌感染治疗中能显著提高患者耐药菌根除率，可改善患者黏膜屏障、减少炎症反应[4]。然而，不同益生菌菌株因其生理代谢特性不同，对不同病原菌的影响程度也不相同。基于此，本研究通过琼脂抑菌试验检测植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊乳杆菌3种益生菌分别对白色念珠菌、肠炎沙门菌、大肠埃希菌、福氏志贺菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌6种常见致病病原菌的抑菌效果并进行比较分析，以期为制定防控医院常见致病菌感染的方案提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 菌株及试剂益生菌(植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊乳杆菌)由江苏韩陵医药研究院有限公司赠送，致病病原菌(白色念珠菌、肠炎沙门菌、大肠埃希菌、福氏志贺菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌)由韩国莱帕坚(株)公司赠送。MRS琼脂、胰酪大豆胨琼脂(tryptic soy agar，TSA)、马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar,PDA)、木糖赖氨酸脱氧胆酸钠琼脂(xylose lysine desoxycholate，XLD)、Baird-Parker琼脂、十六烷三甲基溴化铵琼脂购自青岛海博生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌菌株的活化分别将病原菌白色念珠菌、肠炎沙门菌、大肠埃希菌、福氏志贺菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌各100 CFU加入50 mL胰蛋白胨大豆肉汤中，于35 ℃需氧条件下培养 24 h；将0.1 mL致病病原菌菌液均匀涂抹于TSA培养基表面，继续在35 ℃需氧条件下培养24 h形成活化的菌落，以形成圆形、不透明菌落为活化菌落。

1.2.2 益生菌菌株的活化分别将益生菌植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊乳杆菌各100 CFU加入50 mL 胰蛋白胨大豆肉汤中，于35 ℃需氧条件下培养24 h，将0.1 mL益生菌菌液均匀涂抹于MRS 琼脂培养基表面，继续在35 ℃无氧条件下培养24 h形成活化的菌落。

1.2.3 致病菌和益生菌样品制备分别挑选活化的致病菌和益生菌菌落，用100 μL无菌生理盐水重悬，然后接种于100 mL 胰蛋白胨大豆肉汤中。致病菌培养于需氧条件、益生菌培养于无氧条件下35 ℃培养24 h。取培养后的所有菌液，4 ℃、3 000 r·min-1离心10 min，去除上清液，将沉淀菌株用无菌生理盐水清洗3次，再用无菌生理盐水稀释为1.5 × 1010CFU·L-1菌株样品，备用。

1.2.4 琼脂抑菌试验检测益生菌对病原菌的抑菌效果植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊乳杆菌、白色念珠菌、肠炎沙门菌、大肠埃希菌、福氏志贺菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的选择性培养基分别为MRS、MRS、MRS、PDA、XLD、TSA、XLD、Baird-Parker琼脂、十六烷三甲基溴化铵琼脂。3种益生菌分别与6种致病菌的选择性琼脂培养基等质量混合，制作混合培养基。将制备好的益生菌与致病菌菌株样品用生理盐水稀释10倍(1.5 × 109CFU·L-1)，取10 μL益生菌和 10 μL 病原菌均匀涂抹于混合培养基表面(实验组)，将10 μL病原菌涂抹于混合培养基表面(阳性对照组)，将10 μL无菌生理盐水涂抹于混合培养基表面(阴性对照组)，于35 ℃无氧环境条件下培养24 h(白色念珠菌与益生菌的混合培养及相应阳性对照组、阴性对照组为好氧条件)。挑取各组混合培养基表面形成的菌落，加入到10 mL 无菌生理盐水，适当梯度稀释，取0.1 mL涂抹于病原菌选择性琼脂培养基表面，于35 ℃无氧环境条件下培养24 h(白色念珠菌与益生菌的混合培养及相应阳性对照组、阴性对照组为好氧条件)，使用光学显微镜计数各组培养皿中的菌落数，计算抑菌率。抑菌率=(实验组菌落数-阴性对照组菌落数)/阳性对照组菌落数×100%[5]。实验重复3次，取均值。

2 结果

3种益生菌对6种病原菌的抑菌率比较结果见表1和图1。植物乳杆菌对白色念珠菌、大肠埃希菌、福氏志贺菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的抑菌率比较差异无统计学意义(F=2.716，P>0.05)；植物乳杆菌对肠炎沙门菌的抑菌率显著低于白色念珠菌、大肠埃希菌、福氏志贺菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌，差异有统计学意义(P<0.05)。鼠李糖乳杆菌对白色念珠菌、大肠埃希菌、福氏志贺菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的抑菌率比较差异无统计学意义(F=2.400，P>0.05)；鼠李糖乳杆菌对肠炎沙门菌的抑菌率显著低于白色念珠菌、大肠埃希菌、福氏志贺菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌，差异有统计学意义(P<0.05)。罗伊乳杆菌对白色念珠菌、大肠埃希菌、福氏志贺菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的抑菌率比较差异无统计学意义(F=0.900，P>0.05)；罗伊乳杆菌对肠炎沙门菌的抑菌率显著低于白色念珠菌、大肠埃希菌、福氏志贺菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 3种益生菌对6种常见病原菌的抑菌率比较Tab.1 Comparison of antibacterial rate of three kinds of probiotics against the six kinds of common pathogens

A：白色念珠菌；B：肠炎沙门菌；C：大肠埃希菌；D：福氏志贺菌；E：铜绿假单胞菌；F：金黄色葡萄球菌。图1 3种益生菌对6种常见致病菌的生长抑制效果Fig.1 Growth inhibitory effect of three kinds of probiotics on the six kinds of common pathogenic bacteria

3种益生菌对白色念珠菌、福氏志贺菌、铜绿假单胞菌的抑菌率比较差异无统计学意义(F=1.000、0.000、0.000，P>0.05)。3种益生菌对肠炎沙门菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的抑菌率比较差异有统计学意义(F=3 426.000、111.000、433.000，P<0.05)。罗伊乳杆菌对肠炎沙门菌的抑菌率显著高于植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，差异有统计学意义(P<0.05)；鼠李糖乳杆菌、罗伊乳杆菌对大肠埃希菌的抑菌率显著高于植物乳杆菌，差异有统计学意义(P<0.05)；罗伊乳杆菌对金黄色葡糖球菌的抑菌率显著高于植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，鼠李糖乳杆菌对金黄色葡萄球菌的抑菌率显著高于植物乳杆菌，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

住院患者尤其是重症加强护理病房的患者往往病情危重、机体免疫功能低下，且治疗中往往需要使用大量抗菌药物，导致医院的常见病原菌对抗菌药物的耐药性较高。肠炎沙门菌、大肠埃希菌、福氏志贺菌感染常发生于食物中毒事件[6]和重症加强护理病房[7]。此外，重症加强护理病房常见致病菌还有金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌。金黄色葡萄球菌可导致局部化脓性感染、伪膜性肠炎、肺炎及心脏内膜炎[8]；以白色念珠菌为代表的念珠菌常通过患者的中心静脉导管，引起细菌性血流感染[9]；铜绿假单胞菌是医院烧伤病房中最为常见的致病菌，易引起坏死性毛细血管炎、绿脓杆菌化脓性血栓性静脉炎、坏死性臁疮。白色念珠菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的感染部位多见于呼吸道、泌尿道、皮肤软组织等；福氏志贺菌、肠炎沙门菌的主要感染部位为胃结肠黏膜的上皮细胞表面。

益生菌的抑菌作用机制主要有4个方面：(1)形成酸性微环境；(2)竞争结合位点，抑制病原菌的黏附和定植；(3)代谢产物的抑菌作用；(4)破坏病原菌细胞膜和细胞内结构[10-11]。本研究结果显示，3种益生菌对白色念珠菌、福氏志贺菌、铜绿假单胞菌的抑菌率均能达到99.9%以上；且植物乳杆菌对白色念珠菌、大肠埃希菌、福氏志贺菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的抑菌率比较差异无统计学意义；鼠李糖乳杆菌对白色念珠菌、大肠埃希菌、福氏志贺菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的抑菌率比较差异无统计学意义；罗伊乳杆菌对白色念珠菌、大肠埃希菌、福氏志贺菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的抑菌率比较差异无统计学意义；说明益生菌植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊乳杆菌对病原菌白色念珠菌、大肠埃希菌、福氏志贺菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌均具有较好的抑菌作用。

本研究结果显示，3种益生菌对肠炎沙门菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的抑菌率比较差异有统计学意义；罗伊乳杆菌对肠炎沙门菌的抑菌率显著高于植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌；鼠李糖乳杆菌、罗伊乳杆菌对大肠埃希菌的抑菌率显著高于植物乳杆菌；罗伊乳杆菌对金黄色葡糖球菌的抑菌率显著高于植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，鼠李糖乳杆菌对金黄色葡萄球菌的抑菌率显著高于植物乳杆菌；原因可能为益生菌植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊乳杆菌对不同病原菌的抑菌作用机制不同。植物乳杆菌的主要生物学特点是活菌率高，可产生细菌素、苯乳酸等抗菌代谢产物，从而形成酸性微环境，发挥抗菌作用[12]；此外，植物乳杆菌能改变病原菌细胞膜的通透性，破坏病原菌的结构完整性，影响细菌蛋白质的合成[13-15]。鼠李糖乳杆菌属于乳杆菌属，主要生物学特点是耐酸，可通过改变致病菌细胞壁的通透性，影响蛋白质和核酸的正常表达从而发挥抑菌作用[16]；此外，鼠李糖乳杆菌还可通过产生代谢物如细菌素，在细菌表面形成孔洞发挥抑菌作用[17-18]。罗伊乳杆菌可破坏病原菌结构，从而抑制病原菌细胞内蛋白质合成[11]；罗伊乳杆菌还可产生抗菌代谢产物，如乳酸、乙酸、乙醇、苯乳酸等，从而发挥抗菌作用[19-21]。

本研究结果显示，3种益生菌对肠炎沙门菌的抑菌率显著低于白色念珠菌、大肠埃希菌、福氏志贺菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌，说明这3种益生菌对肠炎沙门菌的抑菌效果欠佳，其原因可能与益生菌培养条件有关，乳杆菌培养条件影响所释放的有机酸和过氧化氢水平[22]。因此，未来可筛选对肠炎沙门菌抑菌效果更好的益生菌，且可通过优化益生菌抑菌环境，提高有机酸释放水平，从而提高对肠炎沙门菌的抑菌活性。

综上所述，益生菌植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊乳杆菌对白色念珠菌、福氏志贺菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的抑菌效果明显，对肠炎沙门菌抑菌效果欠佳。