江青东

(河南牧业经济学院 畜产品质量安全技术研究院，河南 郑州 450046)

2020年7月1日，国家明确规定严格禁止在饲料中添加抗生素，以确保健康养殖、绿色养殖的可持续发展。同时，为提高畜禽养殖过程中疫病的预防和治疗效果，寻找抗生素的替代品已成为当务之急。随着科技的发展，微生物中药发酵产物在畜禽疫病预防与治疗过程中的显著疗效已被人们所接受。植物提取物、益生菌、抗菌肽等也是当前畜禽养殖生产过程中用来代替抗生素的常用物质[1]。

资料表明，微生物不仅分解转化物质的能力强，而且还能产生丰富的代谢产物[2，3]。乳酸菌具有调节胃肠道微生态平衡、提高畜禽对饲料的吸收转化能力及提高畜禽机体免疫力等功效[4-6]。研究发现，中药党参和黄芪在经过乳酸菌FGM9菌株发酵后，其发酵产物中的粗多糖含量得到明显提高[7，8]。本文就乳酸菌FGM9菌株的毒性作用开展实验研究，以确认其生物安全性，为其作为中药发酵菌种奠定基础。

1 试验材料

1.1 供试动物

64只健康SPF小鼠，体重约25 g左右，雌雄各32只。试验分8组，每组8只，雌雄各4只，饲养于小鼠笼，常温下饲养7 d后开始试验。

1.2 试验菌株

乳酸菌FGM9由河南省农业科学院畜牧兽医研究所提供。

1.3 试验仪器设备

血液分析仪购自日本希森美康医用电子有限公司、精密天平购自北京爱尚阳光科技有限公司、冷冻离心机购自鑫贝西科学仪器有限公司，厌氧罐购自北京缘生化科技有限公司、全温振荡培养箱购自成都精密设备有限公司。

1.4 培养基及菌液的配制

1.4.1 MRS琼脂

将柠檬酸三铵1.5 g、K2HPO42.0 g、MgSO40.25 g、酵母膏6.0 g、葡萄糖25.0 g、琼脂粉15.0 g、蛋白胨10.0 g、牛肉膏12.0 g、MnSO40.1 g、三水合乙酸钠6.0 g溶解于1 000 mL蒸馏水，调整pH值为6.5，高压灭菌备用。

1.4.2 MRS肉汤

将酪蛋白酶15.0 g、葡萄糖25.0 g、MnSO40.1 g、乙酸钠5.5 g、MgSO40.25 g、牛肉膏15.0 g、柠檬酸三铵2.5 g、酵母膏5.0 g、K2HPO42.5 g、吐温80 1.0 mL溶解于1 000 mL蒸溜水，调整pH值为5.7，高压灭菌备用。

1.4.3 菌液配制

将已活化的FGM9菌株接种于配制好的MRS肉汤培养基中，培养24 h。4 000 r/min离心20 min,弃去上清液,用灭菌的0.9% NaCl溶液配制低、中、高3个浓度的灌胃组菌悬液，浓度分别为5×106、5×108、5×1010cfu/mL。吸取在MRS琼脂培养基中培养的FGM9菌苔，用灭菌0.9% NaCl溶液配制腹腔注射组低、中、高3个浓度的菌悬液，浓度分别为6×106、6×108、6×1010cfu/mL。将以上配制好的菌悬液置于4 ℃冰箱保存备用。

2 方法

菌液灌注前，将8组小鼠禁食12 h后分别进行称重记录。将已配制好的灌胃组低、中、高3个浓度的菌悬液(浓度分别为5×106、5×108、5×1010cfu/mL)分别灌胃1组，另设1个阴性对照。腹腔注射组低、中、高3个浓度的菌悬液(浓度分别为6×106、6×108、6×1010cfu/mL)分别设1个腹腔注射1组、1个阴性对照组。灌胃组每天上午10∶00和下午15∶00灌注2次，剂量为0.6 mL只/次，连续灌注7 d，阴性对照组用等量灭菌生理盐水。腹腔注射组上午10∶00和下午15∶00注射2次，剂量为0.4 mL只/次，连续腹腔注射7 d，阴性对照组使用等量灭菌生理盐水。

3 数据统计分析

所有数据均用X±SD表示,采用SPSS 17.0软件进行数据统计和分析,多组间比较用方差分析F检验，组间比较采用SNK检验。

4 结果与分析

4.1 体重变化

试验结果显示，试验组和对照组小鼠的体重增加符合正常生长规律，其中灌胃组的中剂量组和腹腔注射的低剂量组小鼠体重显著增加(P<0.05)，分别高于空白对照组。结果见表1。

表1 小鼠体重变化

4.2 脏器系数变化

对试验组和对照组小鼠的内脏器官的(胸腺、脾脏及肝脏系数)变化情况进行比较，经数据统计分析，灌胃组、腹腔注射低剂量组和中剂量组的胸腺系数与对照组相比均差异显著(P<0.05)；灌胃和腹腔注射的高剂量组的脾脏系数与对照组相比差异显著(P<0.05)；其他均无显著差异，结果见表2。

表2 小鼠胸腺、脾脏和肝脏系数变化

脏器系数=脏器重/体重×100%

4.3 血液指标变化

腹腔注射组血液中各个指标及灌胃组血液中各个指标均差异不显著(P<0.05)。经分析发现，灌胃各组红细胞、血红蛋白的平均值略高于腹腔注射组。结果见表3、表4。

表3 腹腔注射组血液中各个指标变化

表4 灌胃组血液中各个指标变化

5 讨论与结论

乳酸菌是一种能发酵多种碳水化合物的益生菌，在畜禽饲料、食品中应用较为广泛，其在发酵过程中会产生各种具有抑菌作用的高活性物质，如酶、小分子肽及细菌素等，能减少胃肠道腐败产物的产生，调节胃肠道微生态平衡，提高畜禽机体免疫应答能力[9-11]。乳酸菌作为抗生素替代物不仅具有成本低、安全性能好、生产周期短、生产工艺成熟等诸多优点，而且应用形式灵活。若其添加在饲料中发酵后能产生有机酸，这不仅可使饲料变得芳香浓郁，提高畜禽适口性及饲料的利用效率，而且还能降解饲料中的霉菌毒素，大大降低畜禽因饲料腐败发生中毒的可能。

研究表明，乳酸菌不同菌株之间具有差异性，个别菌株对畜禽机体具有致病性[12-15]。因此，在用于发酵中药或作为饲料添加剂使用之前要对其安全性进行综合性评价。本试验以小鼠为动物载体通过灌胃和腹腔注射两种途径来研究乳酸菌FGM9对其体重、组织病理学和血液学等的影响，综合评价FGM9菌株毒性。试验结果表明，小鼠体重增加正常，对其体内主要脏器无病理性损伤，血液学指标正常。乳酸菌FGM9在中药发酵用于畜禽养殖过程中，对畜禽健康不会产生负面影响，作为发酵菌株应用于畜禽养殖替代抗生素可行、可靠、安全。