李江涛，邵文华，周文杰，余莲英，杨谦

（江西省九江市第一人民医院消化内科，九江 332000）

食管癌是全球第八大常见癌症， 也是第六大最常见的癌症死亡原因[1-2]。 食管癌一旦发生，通常会迅速侵袭周围组织和淋巴结[3]。 由于没有早期症状、疾病的侵袭性和晚期诊断，其预后通常不佳[4]。 食管鳞状细胞癌（Esophageal Squamous Cell Carcinoma,ESCC） 是世界范围内食管癌的主要组织学类型。ESCC 的病因尚不清楚， 流行病学研究表明吸烟、大量饮酒、 微量营养素缺乏和饮食致癌物暴露可能导致恶性肿瘤[5]。 感染因子被认为是直接致癌物或促进因素，特别是人乳头瘤病毒（HPV）已被假定为ESCC 的可能原因[6]。 目前研究证实了ESCC 中存在HPV。16 型和18 型HPV 是已知与头颈，尤其口咽部肿瘤密切相关。 病毒致癌基因产物E6 和E7 在HPV 相关致癌作用中起关键作用[7]。 HPV 阳性肿瘤的特点是p16 的高表达， 其被认为是鳞状细胞癌背景下HPV 感染的替代标志物。 一些回顾性临床研究表明，HPV 阳性的头颈部鳞状细胞癌患者比HPV 阴性肿瘤预后更好[8]。 与口腔、扁桃体和咽部一样，食道也可以感染这些病毒。 据推测，头颈部鳞状上皮和食道之间的组织学相似性暗示关联和临床特征。虽然既往有研究已经在ESCC 患者中分析了HPV 状态的预后价值，但结果存在很大争议。 本研究旨在确定本地区ESCC 中HPV 感染的患病率并评估其临床意义。 此外，本研究还试图评估HPV 状态对九江地区ESCC 患者生存率的影响。

1 材料与方法

1.1 纳入患者和组织样本 选取2011 年7 月至2016 年5 月间九江市第一人民医院收治的原发性食管癌患者共131 例。男性82 例，女性27 例，患者中位年龄为61 岁（42～79 岁）。纳入：经过病理诊断为原发性食管癌且为鳞状细胞亚型的患者；病理组织标本齐全；术前未接受过放化疗；围术期未发生严重并发症；病历资料完整。 排除：手术后30 天内死亡的患者；非鳞状细胞亚型；无法回答问题或无法联系的不合作患者。患者石蜡组织取自病理实验室。 其中，来自109 名患者的样本具有足够的ESCC肿瘤组织来检测HPV 和p16 最终纳入本研究中。所有组织行苏木精和伊红（H&E）染色，确保组织来源于食道癌组织。 剩余组织用于HPV 和p16 的检测。所有组织学实验均由同一组病理医生完成并出具报告。研究报九江市第一人民医院伦理委员会批准。

1.2 随访调查 从所有患者术后随访数据中获取以下参数：性别、年龄、肿瘤位置、术后病理T 和N状态（pT 和pN）、 根据美国癌症联合委员会TNM分期系统的TNM 分期、肿瘤的分化等级、辅助治疗以及吸烟和饮酒的习惯。肿瘤的解剖定位分为食管上部（15～24 cm）、中部（25～34 cm）和食管下部（35～46 cm）。 肿瘤状态分为局部（原发性肿瘤有或没有局部淋巴结转移）或晚期疾病（有远处转移）。酒精摄入的界值是0.025 公斤/天， 临界值制定参考2011 年中国居民膳食指南。 所有患者都有定期的随访计划，包括完整的病史和体格检查，在手术后的前2 年中每3 个月一次，之后每6 个月一次。必要时进行常规放射学检查和食管镜检查。 患者被随访至死亡或最多5 年。

1.3 HPV 检测 使用生物素化探针的原位杂交法评估所有样本的HPV-16 和HPV-18。 即：切片进行常规脱蜡；进行热诱导靶标修复；使用蛋白酶K消化； 然后应用HPV-16 生物素化DNA 探针；将切片变性并用二氨基联苯胺检测系统染色； 切片用苏木精复染；通过HPV-18 生物素化DNA 探针进一步评估所有肿瘤的HPV-18。阳性对照是宫颈鳞状细胞癌样本。 所有组织均评分为阳性或阴性。局限于受感染肿瘤细胞核的棕色染色被定义为阳性， 所有评分均在不了解p16 免疫组织化学结果的情况下进行。

1.4 p16 免疫组化 p16 免疫组化检测： 福尔马林固定；石蜡包埋的肿瘤标本脱蜡；Tris-EDTA（PH=9.0） 热诱导表位修复进行抗原修复； 通过DakoEnvision-System 方法使用针对p16 的一抗孵育。 p16 阳性定义为＞50%的细胞显示出强烈的核和细胞质免疫标记。 所有评分均在不了解临床特征或结果的情况下进行。

1.5 统计分析 所有分析均使用SPSS 23.0 进行。统计分析包括人口统计学和术后结果数据的单变量分析。 对于这些分析， 使用连续变量的Mann-Whitney 检验和分类变量的卡方检验或Fisher 精确检验来检验组间差异的显著性。Kaplan-Meier 法和log-rank 检验用于分析和比较生存曲线。 主要终点是总生存期（OS），定义为从手术日期到死亡的时间。 次要终点包括无进展生存期（PFS），定义为从手术日期到死亡或首次记录的复发的时间，被归类为局部区域疾病 （原发部位或区域淋巴结的肿瘤）或远处转移。 没有记录的复发部位的原发癌死亡或不明原因的死亡被认为是局部区域疾病导致的死亡。 在单变量和多变量分析中，Cox 比例风险模型用于确定变量对5 年OS 和PFS 的风险比（HR），结果以HR 及其95%置信区间（CI）的形式给出。 P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 纳入患者特征比较 共有109 名患者（82 名男性和27 名女性）符合方案研究标准。 在手术日期时，患者的中位年龄为61（42～79）岁。 根据肿瘤HPV 状态将患者分为两组。HPV 阳性和HPV 阴性患者的基线特征见表1。两组患者在性别、年龄、pT状态、pN 状态、TNM 分期、吸烟和饮酒等方面为差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 HPV 阳性和HPV 阴性患者的基线特征

2.2 HPV 和P16 分析 109 例ESCC 患者中有31例经原位杂交确定为HPV 阳性， 所有阳性病例均为HPV-16，无HPV-18 DNA 呈阳性的患者。 HPV阳性组的中位年龄为61 岁（44～76 岁），HPV 阴性组为62 岁（42～78 岁）。 31 例HPV 阳性肿瘤中有26 例经免疫组织化学染色呈p16 阳性。 p16 表达与HPV 阳性密切相关（P＜0.001），见表2。

表2 食管鳞癌中HPV 原位杂交与p16 免疫组化的相关性

2.3 生存分析 根据Kaplan-Meier 分析，HPV 阳性肿瘤患者的生存率高于HPV 阴性肿瘤患者（logrank P=0.003）。 HPV 阳性亚组的5 年OS 率为67.3%，HPV 阴性亚组为42.8%。 HPV 阳性患者的PFS也显着优于HPV 阴性患者（P=0.003）。 5 年PFS 率分别为62.4%和39.5%。 此外，肿瘤中HPV 和p16表达的存在具有良好的一致性 （r=0.60，P<0.0001）。 使用p16 表达作为分层因素， 我们发现OS 和PFS 的差异与基于HPV 状态的差异一致，p16 表达阳性亚组的5 年OS 率为66.2%， 阴性亚组为47.9%（P=0.031）。5 年PFS 率分别为57.6%和39.2%（P=0.009）。 进行单变量分析显示肿瘤HPV状态（HR=3.22，95%CI=1.56 至6.42）与PFS 相关。多变量分析显示调整pT 状态、pN 状态、TNM 分期和吸烟后， 肿瘤HPV 状态与死亡风险独立相关，即：HPV 阳性肿瘤患者的死亡风险比HPV 阴性患者低62.1%（调整后的OR=0.39，95%CI=0.15 到0.81，P=0.020）；肿瘤HPV 状态也与PFS 具有统计学显着相关性，HPV 阳性肿瘤患者的进展风险比HPV 阴性肿瘤患者低61.3%（调整后的HR=0.35，95%CI=0.14 至0.73，P=0.006）。

3 讨论

HPV 对鳞状上皮具有嗜性， 可导致其过度增殖性病变。目前已确定130 多种HPV 类型，这些类型已根据其致癌潜力分为低风险或高风险型。 高危型HPV 与恶性肿瘤密切相关。根据之前的研究，HPV-16 是鳞状细胞癌中最常见的类型， 其次是HPV-18， 而其他高危型HPV 类型很少。 HPV 在ESCC 中的病因学作用仍不清楚。 ESCC 中HPV 的发病率因地理区域而异。 据推测，ESCC 高发区的HPV 感染率高于ESCC 低发区[9]。 在本研究中，我们观察到九江地区HPV 感染与ESCC 之间的关联， 通过使用原位杂交在28.44%的病例中检测到HPV，并且所有病例均为HPV-16 阳性。 该观察结果与之前在中国其他ESCC 高危地区的研究一致[10]。 在本研究中，我们还发现HPV 阳性和阴性ESCC 肿瘤位置存在微小的差异（P=0.09），食管上段HPV 感染高于下段。这可能的原因是HPV 感染的途径以及口咽鳞状上皮和上消化道之间的组织学相似性。 HPV 目前是全世界最常见的性传播感染之一。 许多研究已经证实，性行为的变化可能能够解释HPV 阳性癌症发病率的增加。 食道可以像口腔、扁桃体和咽部一样感染这些病毒。

在本研究中，31 例HPV 阳性ESCC 病例中有26 例表达p16， 而78 例HPV 阴性亚组中有15 例表达p16。 我们观察到通过原位杂交获得的肿瘤HPV 状态与通过免疫组织化学获得的p16 之间有很强的一致性。 HPV 原位杂交检测对单个病毒拷贝具有敏感性，阳性结果与HPV E6 和E7 癌基因的表达密切相关。 本研究的一个缺点是未检测除HPV-16/18 之外的其他亚型。 p16 的表达对HPV类型没有特异性。 因此，p16 免疫组化是ESCC HPV 感染的一个很好的替代指标。

此外， 先前研究已经在ESCC 患者中分析了HPV 状态的预后价值。 然而， 结果引起了很大争议。 Furihata 等[11]报道，在食管癌患者中HPV 阳性患者的生存率低于p53 过表达的HPV 阴性患者，因此认为HPV 感染和p53 过表达表明预后不良。Hippelainen 等[12]报道，61 名ESCC 患者中有11%的患者HPV 阳性，但没有预后价值。 Dreilich 等[13]发现与低病毒载量的患者相比， 高病毒载量的患者具有更高的存活率。 而我们的研究发现， 肿瘤HPV 状态是ESCC 患者OS 和PFS 的独立预后因素。 其他研究回顾性也一致地显示，HPV 阳性肿瘤患者具有比阴性患者更好的预后。 在体外研究中，HPV-16 转染卵巢癌细胞的顺铂敏感性增加，这意味着更好的预后[14]。 免疫系统、HPV 状态和预后之间的关系仍然是一个有趣的研究领域。 外周血中较高百分比的CD8 细胞和较低的CD4/CD8 比率以及较高的肿瘤微环境中CD4 和CD8 浸润的平均总和可能预示着更好的结果。 HPV 的整合导致癌蛋白E6/E7 的更高表达，从而削弱p53 和Rb 蛋白功能，促进基因组重排。 理论上，重排的DNA 对放疗和化疗更敏感， 这为HPV 阳性肿瘤患者的生存率更高的迹象提供了部分解释。

本研究尽管在HPV 阳性和阴性之间差异有统计学意义，但由于该研究样本量小且具有回顾性，因此得出的结论可能具有偏倚性。 需要更大规模的验证性研究来提供明确的证据。 此外，本研究无法确定HPV 感染和ESCC 发病的时间顺序， 尽管观察到感染与肿瘤之间的关联， 但暴露与结果之间的因果关系并不清楚。 但本研究为未来的临床研究提供了方向。